用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液及其制备方法，所述复性液主要由精氨酸、EDTA、氧化型谷胱甘肽、Tris和甘油组成，其中各组分浓度分别为：0.2～0.8M精氨酸、0.5～2mM?EDTA、0.3～0.9mM氧化型谷胱甘肽、60～100mM?Tris、甘油含量15～30％(v/v)，复性液pH为8.0～8.5，该复性液通过溶解在蒸馏水中并用HCl调节pH的方法制得，所述复性液在重组鸡α干扰素包涵体方面具有应用前景；所述复性液通过对各组分的合理配比，使包涵体蛋白通过三步洗涤纯化及点滴加样一次复性的工艺方法，将菌体蛋白与包涵体很好的分离，使蛋白质的复性率大大提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种复性液及其制备方法与应用，尤其是一种用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液及其制备方法与应用。
技术介绍
干扰素(英文interferon，缩写为IFN)是一类由细胞分泌的高活性、多功能细胞因子，其主要作用是抑制病毒增殖及抗肿瘤，提高身体抗病毒能力。鸡干扰素分子量为17 34KD的蛋白质具有蛋白质通性，对热稳定，2-8°C可保存很长时间，20°C可长期保存其 活性，56°C则被破坏，pH2 10范围内干扰素不被破坏，易被核酸酶中和，可被蛋白酶灭活。基因工程鸡α干扰素是无毒、无害、无残留的生物制品，对抑制病毒的复制和提高机体免疫力方面有一定的功效；大肠杆菌是目前最为被广泛用来表达外源蛋白的表达系统，然而大肠杆菌大量表达重组蛋白质常常导致其聚集体并形成蛋白沉淀-包涵体，包涵体蛋白没有生物活性，需要复杂的溶解、复性和纯化来得到有功能的产品。目前蛋白质复性通常有两种方法。一是稀释法，稀释溶有蛋白的变性液，溶液中变性剂浓度足够低时，蛋白开始复性；二是透析法，用透析、超滤等手段除去变性剂。稀释法操作液体量大，同时蛋白质浓度小，为后续的提纯蛋白增加了困难，同时也增加了生产成本；透析法对设备要求较高，增加了设备的投入，同时操作时间较长，可能导致蛋白质沉淀。目前，包涵体的复性率大概为15-25%，大部分宝贵的目的蛋白因为不能复性而不能被利用。复性率较低的原因主要是在重组蛋白的复性过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适而无法形成正确的次级键等。因此，寻找一种有效的复性液及蛋白质复性方法，使其既能提高蛋白复性率又能有效降低复性成本，对于基因重组蛋白药物生产具有非常重要的生产实践意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液的制备方法。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液的制备方法应用。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是一种用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液，主要由精氨酸、EDTA、氧化型谷胱甘肽、Tris和甘油组成，其中各组分浓度分别为0. 2 O. 8M精氨酸、O. 5 2mM EDTA,O. 3 O. 9mM氧化型谷胱甘肽、60 IOOmM Tris、甘油含量15 30% (v/v)。优选的，上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液，所述复性液pH为8. O 8. 5。优选的，上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液，其中各组分浓度分别为O. 4 O. 6Μ精氨酸、O. 5 I. 5mM EDTA,O. 5 O. 8mM氧化型谷胱甘肽、70 85mM Tris、甘油含量15 25% (v/v)，复性液pH为8. O 8. 3。优选的，上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液，其中各组分浓度分别为O. 2Μ精氨酸、O. 5mM EDTA、0. 3mM氧化型谷胱甘肽、60mM Tr i S、甘油含量15% (v/v)，复性液pH为8. O。优选的，上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液，其中各组分浓度分别为O. 5Μ精氨酸、1.5mM EDTA、0. 6mM氧化型谷胱甘肽、75mM Tris、甘油含量20% (v/v)，复性液pH 为 8. 2。上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液的制备方法，具体制备步骤如下(I)按上述各组分比例关系准确称取各组分；(2)将各组分在蒸馏水中充分溶解；⑶用HCl调节pH值。优选的，上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液的制备方法，所述步骤(3)中用HCl调节ρΗ8· O 8. 5。上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液在重组鸡α干扰素包涵体方面的应用，具体方法步骤为(I)提取包涵体蛋白离心收集菌体，并将菌体超声破碎后高速冷冻离心，得到鸡α干扰素包涵体蛋白质；(2)纯化包涵体蛋白质首先按质量体积比I : 10 I : 40将包涵体重悬于第一洗涤液中高速冷冻离心；然后按质量体积比I : 10 I : 40将包涵体重悬于第二洗涤液中高速冷冻离心；最后按质量体积比I : 20 I : 50将包涵体重悬于第三洗涤液中高速冷冻离心，所述第一洗漆液的组分配比为NaC1137mmol/L、KCl 2. 7mmoI/L^Na2HPO4 IOmmol/UKH2PO4 2mmol/L、0. 2%~ I. 4%的 tritonX_100、pH 8· O 8· 5 ;第二洗涤液为 I 3mol/L尿素；第三洗涤液为O. 6 2mol/L NaCl ；(3)溶解与复性包涵体蛋白质按质量体积比为I : 10 I : 50将步骤⑵离心后所得沉淀用变性剂重悬，室温放置至沉淀逐渐溶解后高速冷冻离心，收集上清液；1-10°C条件下，使上清液逐滴加入到本专利技术所述复性液中，体积比为I : 50 I : 100，同时搅拌12 24h，所述变性剂的组分配比为每5 7M盐酸胍中I 2mM EDTA,20 50mM Tris、6 IOmM DTTλ pH 8· O 8· 5。上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液在重组鸡α干扰素包涵体方面的应用，所述步骤(I)中离心收集菌体条件为4°C、4000 6000rpm/min、10 20min,将菌体超声破碎条件为功率400瓦、工作3秒、间歇7秒、工作时间15 30分钟，高速冷冻离心条件为4°C、8000 10000rpm/min、10 20min ;步骤(2)中包涵体重悬于第一洗漆液、第二洗 涤液和第三洗涤液后高速冷冻离心的条件均为4°C、8000 10000rpm/min、10 20min ;步骤(3)中高速冷冻离心条件为4°C、8000 10000rpm/min、10 20min,同时4°C条件下使上清液逐滴加入到本专利技术所述复性液中。优选的，上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液在重组鸡α干扰素包涵体方面的应用，所述步骤(I)中菌体为大肠杆菌。优选的，上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液在重组鸡α干扰素包涵体方面的应用，所述步骤(3)中变性剂的组分配比为每6Μ盐酸胍中I. 5mMEDTA、30 40mMTris>8mM DTT> pH 8.5。本专利技术的有益效果是上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液通过对各组分的合理配比，使包涵体蛋白通过三步洗涤纯化及点滴加样一次复性的工艺方法，将菌体蛋白与包涵体很好的分离，使蛋白质的复性率大 大提高，同时简化了复性步骤及所需设备，节约了时间，从而大大提高了目的蛋白的收获率，降低重组鸡α干扰素的生产成本；该复性液的制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术所述技术方案作进一步的说明。实施例I一种用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液，主要由精氨酸、EDTA、氧化型谷胱甘肽、Tris和甘油组成，其中各组分浓度分别为0. 2M精氨酸、O. 5mMEDTA、0. 3mM氧化型谷胱甘肽、60mM Tris、甘油含量15% (V/V)，复性液pH为8. O。上述用于重组鸡α干扰素包涵体的复性液的制备方法，具体制备步骤如下(I)按上述各组分比例关系准确称取各组分；(2)将各组分在蒸馏水中充分溶解；(3)用 O. lmol/L HCl 调节 ρΗ8· O。上述用于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高应瑞，
申请(专利权)人：天津生机集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：