本发明专利技术公开了生活在酸性矿山废水（AMD）的一种未知微生物所含有的一种对重金属镉抗性的基因即P型ATP酶，以及该基因所编码蛋白质分子的氨基酸序列。转化大肠杆菌实验证明该基因在大肠杆菌中的表达可以提高其对重金属镉的抗性。本发明专利技术可用于提高微生物和植物对重金属镉的抗性，进一步用于清除环境重金属污染，为生物修复提供性能优良的生物资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程，和生物修复领域。具体地说，本专利技术提供了生活在酸性矿山废水(acid mining drainage, AMD)的ー种未知微生物所含有的ー种对重金属镉抗性的基因即P型ATP酶(FKCadAl)的序列，以及该序列推测编码蛋白质分子的氨基酸序列。本专利技术在提高微生物和植物对重金属镉的 抗性方面有着重大的应用价值。
技术介绍
随着矿产资源的开发利用、エ业发展，重金属对环境造成的污染日趋严重，土壌重金属污染已经成为ー个危害全球环境质量的问题。土壌重金属会影响植物的生长发育，降低农作物的产量和质量，带来了严重的经济损失。此外，受土壤重金属污染的作物在植物体中积累，并通过食物链富集到人体和动物体中，危害人畜健康，引发癌症和其他疾病等。治理重金属污染刻不容缓，各种修复技术和措施正在研究和应用中。各国政府和科学家着力通过两个途径解决这ー问题ー为利用物理的，化学的方法试图清除土壌或水体的重金属污染ニ为利用现代生物技术清除污染。自从20世纪80年代以来，生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的广泛关注。生物修复一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型，其中植物修复和微生物修复是研究的热点。微生物修复就是利用微生物将环境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程。近年来，基于微生物对重金属的作用机理，以修复有毒有害金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日趋成熟。植物修复指利用植物去治理水体、土壌和底泥等介质中的污染的技木。然而用于重金属污染修复的生物往往会受到重金属的毒害，生长缓慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金属对植物和微生物的毒害作用是生物修复的主要限制因素。解决生物修复中重金属对生物的毒害作用的根本途径在于研究耐受重金属的分子生物学机制，克隆对重金属耐受的关键基因，通过基因工程手段获得用于生物修复中性能优良的转基因工程生物。由于技术上的原因，直到最近，对微生物基因资源的利用主要局限于可培养微生物。然而，已培养微生物仅占自然界中微生物的不到1%，因此各种生境中的微生物宏基因组是ー个巨大而未发掘的基因资源库。极端环境具有丰富的微生物资源，当中许多与逆境和关键生命过程相关的基因在长期的适应进化中获得了更强的耐性潜能，发掘这些抗性基因已成为国际重要的研究热点。酸性矿山废水(AMD)是极端生境微生物学研究的重要系统。AMD来源于采矿活动使含硫矿物(主要为黄铁矿，FeS2)暴露于空气和水中，在微生物催化作用下迅速氧化产酸所致，其PH值一般在1-4左右，而且富含硫酸盐以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金属，是采矿业面临的最严重环境问题之一。在AMD中生存的原核微生物在长期的进化过程中逐渐形成了ー些独特机制，以应对低PH值、高盐度以及高重金属等多种极端环境协迫。因此，AMD生境成为极具特色和丰富的抗逆基因库。由于ー些金属在高浓度时具有毒性，因此微生物通过减少运输、阻渗作用或排出作用构成对重金属的抗性。微生物 虽然可以通过累积、氧化还原等方式抵御环境中过量的重金属离子，但它们仅作为细胞暴露于较低浓度重金属环境中的有效解毒方式，在高浓度重金属污染的环境中，快速生长的任何生物都必须通过作为单独的或者联合其它方式的外排作用来解毒。因此，最有效率的方法是直接将重金属离子运输出细胞外。微生物中存在许多与金属离子运输有关的蛋白家族，它们大多位于细胞膜上，起着离子泵的作用。P型ATP酶就是其中之一。在P型ATP酶中，运输子的跨膜通道以及ATP的结合和水解位点均是由一条多肽链构成，它只能运输包括质子在内的一价和二价无机阳离子。在P型ATP酶家族中，最引人注意的特点就是在其N端有高度的保守区域，估计为金属的结合位点，在水解ATP供能的情况下，改变通道构像形成离子通道，将金属离子送出胞夕卜。大肠杆菌染色体上有四种不同的P型ATP酶，其中一种是MgtA，用来吸收Mg2+，其他三种运输K+、Cu2+和输出Zn2+。P. Putida KT2440中有两种P型ATP酶，CadA2用来运输Cd2+和Pb2+，而CadAl的作用目前还不清楚。CadA2的功能在P. Putida 06909中也研究得非常清楚了，它负责Cd2++和Zn2+的运输。在P.Putida CD2中，也有两种P型ATP酶，CadA2提供Cd2+、Zn2+和Pb2+的抗性，而其中CadAl的作用目前亦不清楚。另外，迄今为止CadAl基因在微生物中对重金属镉抗性究竟起什么作用仍不清楚，也没有从AMD微生物中克隆到CadAl基因的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供AMD微生物中的P型ATP酶，以及编码该蛋白的新基因，为今后开发基因工程产品奠定物质基础。在本专利技术的一个方面，提供了一种酸性矿山废水微生物中P型ATP酶(重金属镉抗性相关蛋白FKCadAl)，它为如下蛋白分子(i)或(ii)⑴具有如SEQ ID NO : I所述的氨基酸序列；(ii)在如SEQ ID NO 1限定的氨基酸序列经过取代，缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质与(i)的蛋白质具有相同的功能。在本专利技术的另一个方面，提供了一种DNA分子，它包括编码所述的P型ATP酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO :2)。专利技术发现FKCadAl蛋白具有金属镉抗性作用，可以在治理环境镉污染中应用。专利技术同时保护了该蛋白的编码基因，具有如SEQ ID NO :2所示的序列；以及该基因在治理环境镉污染中的应用。专利技术用表达FKCadAl的基因工程菌作为试验对象，发现在镉胁迫下，其镉耐受性大大高于非基因工程菌。在镉离子浓度为200 μ M以下时，尤其是150 μ M以下时，仍有较高的存活率。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果本专利技术从AMD微生物中克隆了一个新的P型ATP酶基因，命名为FKCadAl，并对其对重金属镉的抗性进行了功能分析。通过大肠杆菌转化实验证明该基因可以提高大肠杆菌中对镉的抗性。应用本专利技术的基因序列或氨基酸序列进行转基因开发基因工程产品面具有重大的应用价值，具体来说可用于培育高生物量的重金属超富集植物或微生物，用于重金属污染土壤和水体的生态修复。附图说明 附图I为FKCadAl在大肠杆菌中的表达时相；其中M :蛋白分子量标准；I :携带空载体pET28a的BL21 (DE3)菌株；2-9 :携带 pET28a-FKCadAl 的 BL21(DE3)菌株诱导表达分别 O、1、2、3、4、5、6、7 小时。附图2为表达FKCadAl的大肠杆菌在不同镉浓度下培养12小时后的生长情況。附图3为表达FKCadAl的大肠杆菌在150 μ M镉胁迫下的生长曲线。具体实施例方式实施例IFKCadAl基因全序列的克隆野外微生物样品采集在云浮铅/锌矿选取不同酸化阶段(以pH为标准)的AMD，使用O. 22 μ m的滤膜收集20LAMD里面的细胞。为了保持核酸的完整保存，保存样品冻于液氮中，24小时内带回实验室，并放于_70°C冰箱长期保存。核酸的提取DNA提取采用SET方法，过程如下向SET buffer中加入溶菌酶及蛋白酶K，消化30min后，15, OOOrpm离心15min后用氯仿抽提2次,用异丙醇沉淀过夜后,75%こ醇清洗2次，最后溶于灭菌水中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢丽娟，陈亮，许光远，俞陆军，胡敏，廖斌，束文圣，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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