一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法技术

本发明专利技术公开了一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，具体是将博来霉素用0.01M的无菌PBS溶液稀释为1mg/ml的浓度注射于大鼠口腔双侧颊黏膜，每次每侧注射100μl，每天一次，注射8周。该方法实施周期短，成本低，操作简单，能够构建出理想的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物病理模型构建领域，具体涉及。
技术介绍
口腔黏膜下纤 维性变(oral submucous fibrosis, 0SF)又称口腔黏膜下纤维化，是一种慢性、隐匿性、具有癌变倾向的口腔黏膜疾病，已经被世界卫生组织定义为癌前状态，国内报道其癌变率为I. 19-2. 04%，国外报道其癌变率高达7-13%。它主要的病理特征包括口腔黏膜上皮组织萎缩或增生，固有层及黏膜下层胶原纤维堆积、玻变，血管闭塞、减少。临床表现为局部或全口黏膜苍白、僵硬，触之呈皮革感，有时伴有腭部水疱、口干等症状。根据流行病学资料，OSF与咀嚼槟榔关系密切，并且其患病风险与咀嚼槟榔的频率和时间呈正相关。在我国，OSF好发于有咀嚼槟榔习惯的湖南、海南和台湾三省。一项来自台湾的报道显示，上世纪90年代，台湾的咀嚼槟榔者约有200万。湖南省最新的流行病学调查结果显示，全省15岁以上的居民中，13. 3%的人目前有咀嚼槟榔习惯，2. 9%的人曾经有咀嚼槟榔习惯，一生的咀嚼槟榔率高达16. 2%，并且呈现出年轻化的发展趋势；0SF的患病率约为I %。高义军等对湖南娄底市的中小学生进行调查后发现，男性咀嚼槟榔率为21. 1%，女性为3. 1%。由此估计，目前湖南省咀嚼槟榔者近千万，OSF患者近百万。不仅如此，咀嚼槟榔习惯在湖南周边省份也逐渐流行开来，湖南省外的OSF病例也时有报道。在我国OSF已经逐渐上升为一种公共健康问题。目前OSF具体的发病机制尚不明确，虽然目前学者们普遍认同其主要是由于槟榔中槟榔碱等成分长期反复刺激口腔黏膜，致使局部胶原合成和降解失衡造成的。临床上已有多种方法用于OSF的治疗，如口服、局部注射中西药物、高压氧和外科手术等，但是仍然缺乏特效治疗手段。缺乏动物模型是制约OSF发病机制及临床治疗研究的一个十分重要的因素。建立OSF动物模型一方面可以为OSF发病机制和临床治疗的研究提供一个模拟人体的平台，另一方面在厘清OSF与口腔癌关系研究中也具有重要的价值。已有很多学者在OSF动物模型的制作方面进行了多种尝试。上世纪60年代Sirsa等先后采用辣椒素和槟榔碱在Wistar大鼠的腭部涂擦来制作OSF的动物模型，但均未能诱导出典型的OSF病变。1987年MacDonald等将槟榔碱涂擦在仓鼠颊囊部位诱导0SF，也未获得成功。1991年Khrime等连续6个月采用pan masala(印度流行的一种槟榔咀嚼物)糊剂隔天刺激albino大鼠口腔黏膜，发现口腔黏膜下胶原沉积增加，而其他病理改变则不够典型。直到2007年Perera等采用槟榔提取物在小鼠的口腔黏膜局部滴300-600天，成功诱导出类似人类OSF的病理改变，为人们提供了一种较成功的OSF造模方法。但是这种方法试验周期长，成本高，操作难度大。再加上小鼠寿命短，其口腔黏膜组织面积太小，也不利于在此基础上进行进一步的实验研究。因此目前OSF仍然缺乏较理想的造模方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，该方法实施周期短，成本低，操作简单，能够构建出理想的口腔黏膜下纤维性变动物模型。将博来霉素注射到大鼠口腔双侧颊黏膜即可。具体方法是将博来霉素用O. OlM的无菌PBS溶液稀释为lmg/ml的浓度注射于大鼠口腔双侧颊黏膜，每次每侧注射100μ I的博来霉素稀释液，每天一次，注射8周。 上述方法中注射时进针位置距大鼠口角2-3mm;博来霉素稀释液现用现配，注射采用5号针头的注射器；大鼠在异氟烷麻醉状态下进行注射。本专利技术采用的博来霉素(Bleomycin，BLM)是一种抗肿瘤药物，其毒副作用低，不会引起白细胞减少，也不抑制机体的免疫功能。主要的副作用有肺纤维化、皮肤纤维化等。据此，BLM已经被广泛地用于建立肺纤维化和硬皮病的动物模型。利用BLM的这一特点，我们采用BLM大鼠颊黏膜局部注射的方法建立了一种周期短、容易复制、病变稳定的OSF动物模型，以供对OSF的研究。附图说明图I为本专利技术具体实施方式中实验大鼠体重变化趋势图；图2为本专利技术具体实施方式中实验大鼠张口度变化趋势图；**表示与对照组相比P < O. 01。图3为本专利技术具体实施方式中实验组大鼠BLM颊黏膜局部注射8周后张口度的测量情况图；图4为本专利技术具体实施方式中对照组大鼠PBS颊黏膜局部注射8周后张口度的测量情况图；图5为本专利技术具体实施方式中实验8周时实验组与对照组大鼠颊黏膜情况图；A 对照组PBS局部注射8周，颊黏膜颜色质地变化不明显。B-H :实验组BLM局部注射8周，颊黏膜局部苍白、僵硬(图中黑色箭头所示)。图6为本专利技术具体实施方式中实验大鼠颊黏膜羟脯氨酸含量变化趋势图；**表示与对照组相比P < 0.01。图7为本专利技术具体实施方式中实验期间实验组和对照组大鼠颊黏膜组织HE染色情况图(XlOO) ;A、C、E、G依次为实验组第2、4、6、8周HE染色情况。B、D、F、H依次为对照组第2、4、6、8周HE染色情况。实验第2周(B)固有层大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，伴少量的浆细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。对照组(A)有少量中性粒细胞浸润。实验第4周(D)上皮钉突变尖，变短。固有层炎症细胞浸润减少，固有层下肌纤维萎缩，细丝状胶原沉积。实验第6周(F)上皮钉突变平、消失，上皮明显萎缩变薄。固有层少量淋巴细胞、浆细胞浸润，钉突逐渐消失。固有层胶原沉积增加，固有层下肌纤维萎缩明显。实验第8周(H)大部分上皮钉突消失，上皮萎缩、变薄。固有层大量胶原沉积，局部玻璃样变。仍有少量淋巴细胞、浆细胞浸润。图8为本专利技术具体实施方式中实验大鼠颊黏膜组织masson染色图(X 100) ；A为正常大鼠颊黏膜，B、C分别为BLM局部注射4周和8周的大鼠颊黏膜，胶原沉积量较正常组大鼠明显增加。图9为本专利技术具体实施方式中实验组大鼠部分组织器官HE染色图(X 100) ；A为BLM颊黏膜局部注射BLM 8周的大鼠肺组织，肺泡间隔变宽，渗出增加，炎症细胞浸润。B-F依次为BLM颊黏膜局部注射BLM 8周的大鼠舌、肝、肾、卵巢及子宫组织，结构基本正常。图10为本专利技术具体实施方式中两组大鼠上皮下血管数变化情况图；*表示P <O. 05, ** 表示 P < O. 01。图11为本专利技术具体实施方式中正常组和实验组大鼠颊黏膜a -SMA表达情况图；A、C、E、G、I依次为正常组、实验组2、4、6、8周大鼠颊黏膜a-SMA表达情况(X100)，B、D、F、H、J为高倍镜时(X400)的表达情况。图12为本专利技术具体实施方式中I型胶原的蛋白表达免疫印迹图；图13为本专利技术具体实施方式中I型胶原蛋白表达直方图；*表示与正常组相比P < O. 05, **表示与正常组相比P < O. 01。图14为本专利技术具体实施方式中III型胶原的蛋白表达免疫印迹图；图15为本专利技术具体实施方式中III型胶原蛋白表达直方图；*表示与正常组相比P < O. 05, **表示与正常组相比P < O. 01。图16为本专利技术具体实施方式中TGF-β I的蛋白表达免疫印迹图；图17为本专利技术具体实施方式中TGF-β I蛋白表达直方图；*表示与正常组相比P<O. 05，#表示与正常组相比P < O. 01。图18为本专利技术具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张珊珊，龚朝建，凌天牖，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：