本发明专利技术公开了一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法，包括下列步骤：(1)通过基因工程方法制备带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6；(2)采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹；(3)收集接种病毒4～6天后的五龄家蚕幼虫或蛹，采用冷冻干燥法制备获得冻干粉；(4)将步骤(3)获得的冻干粉与粉状鱼饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为1～10%。本发明专利技术可以直接作为口服疫苗使用，具有制备工艺简单、成本低、方便使用，具有蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗双重功能等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种利用家蚕生物反应器制备草鱼出血病口服疫苗的方法。
技术介绍
^jkiCtenopharyngoclon是我国淡水养鱼的主要品种,其产量约占淡水养殖总产量的20%。但草鱼病害多，其中以草鱼出血病(hemorrhagic disease of grasscarp)最甚，由草鱼出血病病毒(Crass Carp Reovirus, GCRV)引起。该病是鱼种培育阶段的最大病害，死亡率高达90%以上，给水产养殖业造成了巨大损失。现有技术中，在草鱼出血病的免疫预防中，主要使用甲醛灭活疫苗。例如，取感染病毒死亡的草鱼，匀浆灭活后过滤，即得到病毒灭活疫苗；也可以采用细胞培养灭活疫苗。灭活疫苗能够对草鱼出血病起到预防作用，但是安全性较差，有毒力返祖现象出现。基因工程疫苗具有抗原性强、保护时间长、安全性好、制备和运输方便等优点，已引起行业内的广泛关注。家蚕杆状病毒表达载体系统(Bombyx mori baculovirus expression vectorsystem )是真核表达系统，已有许多基因在该系统中成功表达。用该系统在家蚕中表达外源基因，表达水平高、产物生物活性好。同时杆状病毒也是一种良好的基因传递载体，已用于向哺乳类动物细胞传递基因研究。目前，未见利用家蚕杆状病毒表达载体系统制备草鱼出血病口服疫苗的报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种采用基因工程方法制备草鱼出血病口服疫苗的方法。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是，包括下列步骤 (1)通过基因工程方法制备带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6 ； (2)将重组杆状病毒BmNPV-IIVP6感染家蚕培养细胞BmN进行扩增，采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹； (3)收集接种病毒4 6天后的五龄家蚕幼虫或蛹，采用冷冻干燥法制备获得冻干粉； (4)将步骤(3)获得的冻干粉与粉状鱼饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为I 10%。上述技术方案中，通过基因工程方法获得重组的带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的家蚕Bombyx mori重组杆状病毒，并用该病毒接种家蚕幼虫或蛹，使重组杆状病毒在虫体大量复制，同时草鱼出血病病毒结构蛋白VP6在家蚕幼虫或蛹中获得到高效表达。将高效表达VP6的幼虫或蚕蛹制成冻干粉，经动物试验证明，冻干粉按1% 10%与草鱼饲料混合，制成口服疫苗制剂，可诱导鱼体产生VP6特异性抗体，具有显著的免疫效果。所述的鱼饲料可以选择现有的任一种草鱼饲料，仅为口服目的加入。为混合方便，鱼饲料应为粉状或先加工成粉状，再与冻干粉充分混合均匀。上述技术方案中，所述步骤(1)具体包括以下步骤 ①根据GenBank已公开的草鱼出血病病毒结构蛋白VP6的cDNA编码序列(GenBank登录号AF403394)，合成5’端和3’端分别带EcoRI和Hind III位点的VP6基因的编码序列，克隆进T-载体，获pMD19T-VP6质粒； ②用EcoRI/Hindlll双酶切消化PMD19T-VP6质粒，回收VP6基因片段，用EcoRI/Hindlll双酶切消化供体质粒pFastBac-Dual，回收pFastBac-Dual片段，将VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和Hind III之间，将VP6基因克隆进pFastBac-Dual载体中的杆状病毒多角体基因启动子下游获得pFastBac-ph-VP6重组质粒； ③以pMD19T-VP6质粒为模板，PCR合成5’端和3’端分别带XhoI和KpnI位点的VP6基因的编码序列，Xhol/Kpnl双酶切后克隆进用Xhol/Kpnl双酶切的pFastBac-ph-VP6中获 pFastBac_VP6-ph_VP6 ； ④根据GenBank已公开的团头鮮Megalobramaamblycephala的P -肌动蛋白启动子序列(GenBank登录号AY170122)合成5’端和3’端分别带SmaI和XhoI位点的P -肌动蛋白启动子序列，克隆进T-载体,获pMD19T-0 -actin质粒； ⑤用Smal/Xhol双酶切pMD19T-^ -actin质粒，回收P -肌动蛋白启动子序列片段，Smal/Xhol双酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，将P -肌动蛋白启动子序列片段插入到pFastBac-VP6-ph-VP6 的 SmaI 和 XhoI 之间，获得 pFastBac-FA-VP6-ph_VP6 重组质粒； ⑥将pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒转化大肠杆菌BmDHlOBac感受态细胞，涂布于LB琼脂培养平板上，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid基因组Bacmid-IIVP6 DNA ； ⑦将Bacmid-IIVP6DNA由脂质体介导转染家蚕培养细胞BmN，培养细胞后取上清，获得重组杆状病毒BmNPV-IIVP6。其中，所述步骤⑥中，LB琼脂培养平板上含有四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG、和 X-gal。将pFastBac-FA-VP6-ph_VP6重组质粒转化大肠杆菌BmDHlOBac感受态细胞,涂布于含四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG、X-gal的LB琼脂培养平板上是为了方便重组Bacmid的筛选，本领域技术人员能够根据需要调整各组份的含量，通常四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG和X-gal在LB琼脂培养平板上的含量分别为10吒/ml、50吒/ml、7 ^g/ml、40M<g/ml 和 100 M-g/ml 上述技术方案中，所述步骤(3)中冻干粉的制作方法是，取收集的五龄家蚕幼虫或蛹，冰浴匀浆，加入3 5倍重量的生理盐水，混匀，过滤，滤液冷冻干燥至水份含量小于2wt%,粉碎过筛,获得冻干粉。优选的技术方案，在接种病毒5天后收集五龄家蚕幼虫或蛹。按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为I 10%。上文中，采用所述家蚕Bombyx mori重组杆状病毒接种家蚕幼虫或蛹的方法为将重组杆状病毒BmNPV-IIVP6感染家蚕培养细胞BmN进行扩增，采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹。进一步地，取5天后家蚕或蛹的血淋巴，分析检测VP6表达水平，结果显示重组VP6占血淋巴总蛋白的5 5. 5%左右。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点 I.由于本专利技术采用家蚕杆状病毒表达系统生产草鱼出血病口服疫苗，家蚕可食，家蚕杆状病毒对鱼类无致病性，表达VP6的家蚕幼虫和蛹可直接冷冻干燥，表达产物无需纯化，可以直接作为口服药物使用，因此具有制备工艺简单、成本低，口服疫苗方便使用等优点，同时可以避免采用注射免疫方案中捕 捞鱼及注射对鱼体损伤的副作用。2.由于用本专利技术技术方案获得的重组家蚕杆状病毒基因组中，同时具有杆状病毒多角体蛋白启动子控制VP6基因的表达元件和团头鲂的P -肌动蛋白启动子控制VP6基因的表达元件，因此，该病毒接种家蚕后，病毒在家蚕中大量复制的同时可以大量表达VP6蛋白，而当鱼食下本专利技术技术方案获得的口服本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，薛仁宇，曹广力，陈辉，刘林，徐诗英，邹勇，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：
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