一株能够代谢木糖的酿酒酵母菌株制造技术

本发明专利技术公开了一株能够代谢木糖的酿酒酵母菌株，所述菌株为酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)BSHH02B，该菌已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC?No.5747。该菌株搭载有一独特的木糖代谢途径，即：一分子木糖经木糖酸、3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸两个中间代谢产物生成一分子丙酮酸和一分子乙醇醛。利用该木糖代谢途径，本发明专利技术所述酿酒酵母BSHH02B能够在好氧条件下快速的利用木糖进行生长，并能够应用于利用含木糖的原料生产化工产品，如乙醇、乙二醇、羧酸等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株酿酒酵母工程菌，尤其涉及一株酵母菌株中搭建了外源的木糖代谢途径的、能够快速代谢木糖的酿酒酵母工程菌株。
技术介绍
可替代石油基燃料和化学品生产技术的开发和储备是保障社会发展和国家安全的必要举措。年产量巨大的木质纤维素原料能够为大规模生物基相关产品生产提供物质基础，因而备受关注。木质纤维素中可利用糖的主要成分是葡萄糖及木糖，鉴于葡萄糖是容易利用的糖分，因此，含量可高达30%但不易利用的木糖的转化是原料充分利用的关键，也是降低生物基化学品生产成本的基础。目前从木糖衍生的产品主要是作为功能食品的木糖醇和木寡糖，及化学品糠醛，但这些产品一方面市场容量有限，另一方面只能依赖木糖含量较高的原料(如玉米芯)生产，因此急需开发葡萄糖、木糖共利用的大宗化学品生产平台以及相应的微生物细胞工厂。酿酒酵母是传统的乙醇生产菌株，人类对其的利用已有几百年的历史，因其良好的生产性能、对环境的高耐受性及公认的食品安全性而被认为是现代生物技术最有应用前景的微生物细胞工厂之一。但是，酿酒酵母因缺少木糖代谢途径而不能利用木糖。因此， 在酿酒酵母中构建木糖代谢途径模块，并进而建立目标产品的产出模块，将木糖转化为燃料或其他大宗化工品，对研究和发展以木质纤维素为原料化工产品生产平台具有重要的意义。在酿酒酵母中搭建的木糖代谢的研究工作已开展多年，主要策略是先将木糖转化成其异构体木酮糖，木酮糖再经过磷酸化这一限速步骤进入磷酸戊糖(PPP)途径，磷酸戊糖途径中间产物再通过糖酵解途径最终转化成丙酮酸并进一步代谢。途径繁琐且效率不高。首先，木糖转化成木酮糖的两条途径在酿酒酵母中的建立均存在局限性。①木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)催化的途径因XR和XDH辅助因子不偶联，造成引入该途径的菌株代谢木糖时氧化还原不平衡，由此造成副产物木糖醇积累的问题始终未能彻底解决； ②木糖异构酶(XI)途径虽然可以避开氧化还原不平衡的问题，但目前也仅有少数几种木糖异构酶在酿酒酵母中实现活性表达，且在酿酒酵母生长温度(30°C左右)下酶活不高，导致发酵过程木糖的转化效率不足。其次，木酮糖需要磷酸化成木酮糖-5-磷酸才能进入磷酸戊糖途径，控制催化这一反应的木酮糖激酶0 )的表达水平则成为另一瓶颈，研究表明 XK酶活低则表现木糖代谢效率不足，酶活高则由于消耗过多ATP而影响细胞生长。最后， 木酮糖-5-磷酸需要经磷酸戊糖途径再进入糖酵解途径才能转化成丙酮酸，磷酸戊糖途径的主要作用是在细胞内为许多大分子(如核酸)合成提供中间产物，可想而知，PPP的转化效率很难在保证自身大分子合成所需的基础上，再满足高效木糖分解代谢需要的代谢产物流量。为了提高酿酒酵母木糖代谢转化效率，很多工作围绕上面三个问题展开研究，包括对代谢途径进行了强化和优化，全局性影响因素分析等。目前，相关的工作仍是研究热点。但能显著提高酿酒酵母木糖代谢转化效率的根本措施应该是避开磷酸戊糖途径。新近在大肠杆菌中建立的木糖代谢途径引起我们的注意。这一途径中，一分子木糖经木糖酸、3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸两个中间代谢产物生成一分子丙酮酸和一分子乙醇醛(图I)。从代谢途径上看，这条通过木糖酸的木糖代谢途径大大缩短木糖到丙酮酸的距离(图1)，不与合成途径竞争，是一种经济节能的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株酵母菌株中搭建了外源的木糖代谢途径的、能够快速代谢木糖的酿酒酵母工程菌株。本专利技术所述能够代谢木糖的酿酒酵母菌株，其特征在于所述菌株为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) BSHH02B,该菌已于2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5747。上述能够代谢木糖的酿酒酵母菌株带有木糖代谢途径，S卩(I)木糖在木糖脱氢酶的催化下生成木糖酸；(2)木糖酸在木糖酸脱水酶催化下生成3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸；(3)3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸在2-酮-3-脱氧木糖酸醛缩酶催化下丙酮酸和乙醇醛。该菌株还带有未解析的乙醇醛代谢途径，可以进一步利用生成的乙醇醛。上述的酿酒酵母菌株的好氧发酵的特征如下在木糖(20g/L)为唯一碳源的全合成营养缺陷型液体培养基SC-ura上的最大比生长速率为O. 361Γ1 ;接种后28小时可收获14g/L菌体干重的最大酿酒酵母生物量，并在 28小时内将木糖利用完全；15小时后会积累少量的木糖醇，并在接种后21小时达到最大值O.44g/L ;好氧条件下，不积累木糖酸、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸和乙醇。相应的出发菌株CEN. PK102-5B (Dr. Peter kotter赠送)不能利用木糖生长。本专利技术所述能够代谢木糖的酿酒酵母菌株的构建方法，步骤是(I)表达载体构建将木糖脱氢酶基因Cc-xylB (Gene ID :7329904)、木糖酸脱水酶基因Ec-yjhG(Gene ID :7438120)和2-酮-3-脱氧木糖酸醛缩酶基因Ec_yjhH(Gene ID :7438121)分别连接在附加体质粒pJFE3上，形成质粒pJFE3_XylB、pJFE3_yjhG和 pJFE3-yjhH ；以pJFE3_yjhH为模板，将Ec-yjhH基因连同它的上下游启动子和终止子连接在质粒pJFE3-yjhG上，形成质粒PJFE3-yjhG-yjhH ；以pJFE3-xylB为模板，将 Cc-xylB基因连同它的上下游启动子和终止子连接在质粒pJFE3-yjhG-yjhH上，形成质粒 pJFE3-yjhG-yjhH-xylB ；(2)通过醋酸锂转化法将步骤(I)中构建的表达载体pJFE3-yjhG-yjhH_xylB转化到酿酒酵母菌株CEN. PK102-5b中；在20g/L木糖为唯一碳源的SC-Ura培养基中测试其利用木糖的性能，筛选获得能够代谢木糖的酿酒酵母菌株。上述的木糖脱氢酶基因(Cc-xylB)来源于新月杆菌(Caulobacter crescentus)； 上述的木糖酸脱水酶基因(Ec-yjhG)来源于大肠杆菌(Escherichia coli);上述的 2-酮-3-脱氧木糖酸醒缩酶基因(EC-yjhH)来源于大肠杆菌(Escherichia coli)。上述构建表达载体所用的附加体质粒PJFE3是现有技术中已有的，该质粒已在山东大学硕士学位论文“不同来源木糖异构酶基因xylA的克隆、分子改造及在酿酒酵母木糖代谢工程中的应用”(葛瑞蕾，2011)公布，质粒PJFE3的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。上述的木糖代谢途径在酿酒酵母中的功能表达为世界首次；与其他酿酒酵母菌株所含有的木糖代谢途径相比，本专利技术所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BSHH02BCGMCC No. 5747菌株所含有的木糖代谢途径具有代谢途径短、不参与PPP途径、经济高效等优点，在好氧条件下，该菌株能够快速的利用木糖进行生长；能够应用于利用含木糖的原料生产化工产品，如乙醇、乙二醇、羧酸等。附图说明本专利技术所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) BSHH02B 已于 2012 年 02 月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈煜，鲍晓明，霍文严，刘怀伟，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：