一种贝氏隐孢子虫体外培养模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种贝氏隐孢子虫体外培养模型的建立方法，先将贝氏隐孢子虫卵囊纯化后，在37~40℃的条件下脱囊，然后取5×104－5×105个C.baileyi卵囊和子孢子混合物或5×105－2×106个纯化的子孢子接种鸡胚气管组织，在37~40℃的条件下培养。本发明专利技术利用鸡胚气管组织培养模型研究鸡源贝氏隐孢子虫发育，并在该体系中完成了C.baileyi部分发育史，建立了一种新的C.baileyi体外培养模型。可以利用该模型进行虫体发育分析、毒力测定、内外基因表达、药物筛选等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种隐孢子虫气管组织培养模型的建立，同时还涉及利用该模型进行隐孢子虫疫苗抗体制备、毒力测定、虫体代谢检测、药物筛选、内、外源基因表达等。
技术介绍
隐孢子虫ifryptosporidium)是一种重要的水源性疾病病原，并可引起免疫抑制病人迁延性致死性腹泻和免疫正常人群急性腹泻，具有广泛宿主范围，可感染人、家畜、家禽、伴侣动物及野生动物等260多种动物，并且可通过水源、食物、空气等多种途径传播，从而引起儿童和免疫抑制病人严重腹泻，以及幼龄动物消化道疾病和幼龄禽类呼吸道疾病， 导致其生产性能下降或死亡，目前已鉴定出24个隐孢子虫有效虫种，其中贝氏隐孢子虫 {C.办沿7印i)是感染禽类的优势虫种，可感染30多种禽类，引起严重的呼吸道症状，其发病率及死亡率较高，禽类隐孢子虫病在世界范围内有广泛报道，2010年，Amer等首次从中国红麻鸭粪样中通过形态学和基于SSU rDNA和HSP70基因分析分离到了 C如i7e_Fi，证明 C.如i7印i已成为野生迁徙鸟中重要生物污染源。据Surl等报道C如对环境抵抗力强，抗力非常强，保存在4 °C 2. 5%重铬酸钾中18个月的抗力抗抗抗抗力抗因此，研究 C.如具有重要的医学和兽医学价值。并且对C如的特性研究可作为其他隐孢虫研究的模型。自1983年Woodmansee和Pohlenz首次报道隐孢子虫体外培养成功完成无性繁殖以来，人们开始隐孢子虫体外培养研究，并取得了令人瞩目的成绩。隐孢子虫某些有效种不仅在体外培养中完成全部发育史，而且目前已有报道利用无细胞培养模型完成两种隐孢子虫的全部发育阶段，为进一步研究虫体的生物学特性和防制药物打下了基础。但到目前为止，关于禽类隐孢子虫体外培养的研究较少，仅分离于病人的C meleagridis在牛肾细胞上(MDBK)进行过培养研究。完整的C. baileyi体外发育只在鸡、 火鸡、鸭、鹧鸪、鹌鹑胚内完成。气管组织培养已用于多种呼吸道病原的培养，如传染性支气管炎病毒的培养等。 据Sawaguchi等报道由于气管培养模型简单、快速，所以尽管有鸡胚可用于传支病毒的体外培养，但在分离和确定传支病毒时用气管组织培养模型比鸡胚培养模型更加有效。由于在实验感染雏鸡呼吸道内通过电镜观察可看到C baileyi有性和其他内生发育阶段，并且C baileyi在一些禽类和其他哺乳动物的原代细胞和一些哺乳动物传代细胞系内不发育，而在鸡胚内发育，但鸡胚培养模型不利于实验观察，所以可用气管组织培养模型来尝试培养C. baileyi这种呼吸道病原。本专利技术将C如i7e_Fi卵囊和子孢子混合物或子孢子接种鸡胚气管环，通过观察气管环纤毛摆动，虫体内生发育，观察C如在鸡胚气管环培养模型中的发育状况，为今后研究C. baileyi毒力、感染性、代谢、内源和外源基因表达、治疗药物筛选等打下基础
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术的技术方案是，先将贝氏隐孢子虫卵囊纯化后，在37 40°C的条件下脱囊，然后取5X IO4 — 5X IO5个C baileyi卵囊和子孢子混合物或5 X IO5IX IO6个纯化的子孢子接种鸡胚气管组织，在37 40°C的条件下培养，观察虫体动态发育和气管纤毛运动强弱变化。所述脱囊的脱囊液为DMEM培养基、1640培养基、胰蛋白酶、牛胆酸盐中的至少一种。接种用隐孢子虫纯化子孢子可以通过无菌双层5 ym聚碳酸酯膜过滤脱囊后卵囊和子孢子混合物得到。本专利技术的有益效果是本专利技术利用鸡胚气管组织培养模型研究鸡源贝氏隐孢子虫发育，并在该体系中完成了 C部分发育史,建立了一种新的C体外培养模型。可以利用该模型进行虫体发育分析、毒力测定、内外基因表达、药物筛选等。附图说明图I为贝氏隐孢子感染鸡胚气管环扫描电镜照片，A :未感染组气管环纤毛 (3000X);B :感染组气管环纤毛(4000X); C :感染组气管环上带虫空泡(1000X ) D :感染组气管环裂殖体(7000X )。具体实施例方式，先将贝氏隐孢子虫卵囊纯化后，在 37^400C的条件下脱囊，然后取5X IO4 - 5X IO5个C baileyi卵囊和子孢子混合物或 5 X IO5 — 2 X IO6个纯化的子孢子接种鸡胚气管组织，在37 40°C的条件下培养，观察虫体动态发育和气管纤毛运动强弱变化。所述脱囊的脱囊液为DMEM培养基、1640培养基、胰蛋白酶、牛胆酸盐中的至少一种。接种用隐孢子虫纯化子孢子可以通过无菌双层5 ym聚碳酸酯膜过滤脱囊后卵囊和子孢子混合物得到。实施例I将培养24 h后纤毛运动活性在80%以上且气管环内部无杂质的气管环分别接种约 5 X 104、5 X IO5个C baileyi卵囊和子孢子混合物(指脱囊前完整卵囊的数量)、5X 105、IX 106、2 X IO6个纯化的子孢子，每种接种10个气管环，另取10个气管环接种80 V灭活10 min卵囊5X IO4个作为清洗过程对照，在上述虫体接种后24 h，用移液器移去各培养孔中培养液，然后吸取PBS将气管环冲洗3遍后移至另I新的24孔培养板内(每孔加I mL含200 IU /mL双抗的DMEM维持液)，然后置于37 V 5%C02培养箱培养，每间隔24 h观察培养液中虫体(新生卵囊，子孢子，裂殖体，裂殖子等)出现情况。实施例2将培养24 h后纤毛运动活性在80%以上且气管环内部无杂质的气管环分别接种约 5X IO4、5X105个C如i7印i卵囊和子孢子混合物(指脱囊前完整卵囊的数量)、5X105、 IXlO6, 2 X IO6个纯化的子孢子，每种接种10个气管环，另取10个气管环接种80 °C灭活 10 min卵囊5X104个作为清洗过程对照，在上述虫体接种后24 h，用移液器移去各培养孔中培养液，然后吸取PBS将气管环冲洗3遍后移至另I新的24孔培养板内(每孔加I mL含200 IU /mL双抗的DMEM维持液)，然后置于38 V 5%C02培养箱培养，每间隔24 h观察培养液中虫体(新生卵囊，子孢子，裂殖体，裂殖子等)出现情况。实施例3将培养24 h后纤毛运动活性在80%以上且气管环内部无杂质的气管环分别接种约 5X104、5X105个C如i7e_Fi卵囊和子孢子混合物(指脱囊前完整卵囊的数量)、5X105、 IXlO6, 2 X IO6个纯化的子孢子，每种接种10个气管环，另取10个气管环接种80 °C灭活 10 min卵囊5X104个作为清洗过程对照，在上述虫体接种后24 h，用移液器移去各培养孔中培养液，然后吸取PBS将气管环冲洗3遍后移至另I新的24孔培养板内(每孔加I mL含 200 IU /mL双抗的DMEM维持液)，然后置于39 °C 5%C02培养箱培养，每间隔24 h观察培养液中虫体(新生卵囊，子孢子，裂殖体，裂殖子等)出现情况。实施例4将培养24 h后纤毛运动活性在80%以上且气管环内部无杂质的气管环分别接种约 5X IO4、5X105个C如i7印i卵囊和子孢子混合物(指脱囊前完整卵囊的数量)、5X105、 IXlO6, 2 X IO6个纯化的子孢子，每种接种10个气管环，另取10个气管环接种80 °C灭活 10 min卵囊5X104个作为清洗过程对照，在上述虫体接种后2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张龙现，张素梅，黄磊，菅复春，赵金凤，宁长申，王荣军，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：