本发明专利技术公开了一种新的腈水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备该重组腈水解酶或含该重组腈水解酶的微生物细胞的方法，以及该微生物细胞在水解邻氯扁桃腈或其结构类似物，生产手性邻氯扁桃酸或其结构类似物的用途。本发明专利技术所述的重组腈水解酶来源于Labrenzia?aggregate，可作为催化剂用于水解拆分邻氯扁桃腈或其结构类似物，具有催化效率高，对映选择性强，反应条件温和对环境友好等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种新的腈水解酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备重组酶的方法，以及该重组腈水解酶在水解邻氯扁桃腈或其结构类似物，制备(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物方面的应用。
技术介绍
(R)-邻氯扁桃酸是抗凝血类药物氯吡格雷的重要手性中间体。而其类似物是一类重要的手性合成砌块，被广泛应用于多种药物的合成。如头孢类半合成抗生素、抗肿瘤及抗衰老药物的重要中间体；也可以作为手性拆分试剂，用于拆分其他的手性药物或医药中间体。目前研究人员已经开发出多种制备(R)-邻氯扁桃酸的方法，主要有化学法和生物法。传统的化学拆分法，主要是利用手性胺类化合物，如α-甲基苄胺、(-)_麻黄碱和辛可宁等，通过与外消旋的邻氯扁桃酸形成非对映异构体盐的方法，得到单一对映体的邻氯扁桃酸。生物法制备00-邻氯扁桃酸已经成为研究的热点。例如，酯酶途径主要有两种 第一种，是在邻氯扁桃酸的羟基上酰化，然后由酯酶催化拆分，从而得到光学纯的产物和剩余底物(Appl Microbiol Biotechnol，2010，86 :83-91)。第二种，则是在邻氯扁桃酸的羧基上甲酯化，然后酶促拆分(Biotechnol Bioeng，2008，101 :460-469)。除了酯酶催化拆分之外，还有文献报道了氧化还原酶不对称还原邻氯苯甲酰甲酸，生成(R)-邻氯扁桃酸(J Chem Technol Biot，2009，84 1787-1792)。腈水解酶能够催化有机腈化合物一步水解为羧酸并产生等摩尔量的氨，该过程反应条件温和，不需要任何辅因子的参与，反应效率高，反应过程具有较好的区域和立体选择性。由于邻氯扁桃腈易于大规模生产且成本低廉；更为重要的是，当(R)-邻氯扁桃腈被对映选择性地酶促水解为(R)-邻氯扁桃酸后，剩余的(S)-邻氯扁桃腈在弱碱性条件下可以自发地消旋转化为外消旋的邻氯扁桃腈，这样理论上可以得到100%的产率。因此，获得对邻氯扁桃腈具有高水解活性和对映选择性的腈水解酶，有利于实现(R)-邻氯扁桃酸的大规模工业化生产。而目前，已知的腈水解酶对于邻氯扁桃腈的底物耐受性普遍较差，多数在 50mmol/L 以下(J Am Chem Soc，2002，124 :9024-9025 ;J Ind Microbiol Biotechnol, 2010,37 :741-750 ；Enzyme Microb Technol，2010，47 140-146)。虽然已有文献报道腈水解酶能够在水-甲苯两相体系中水解200mM邻氯扁桃腈，但其产率和ee较低，产物浓度 157mmol/L, ee = 90. 4% (J Biotechnol, 2011，152 :24-29)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种新的水解邻氯扁桃腈获得手性(R)-邻氯扁桃酸的腈水解酶，该腈水解酶在所述催化反应中底物耐受性好，产率和ee值较高，具有催化活性高、对映选择性强、对环境友好的优点。本专利技术还提供该腈水解酶基因以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组腈水解酶的应用。本专利技术通过下述技术方案解决上述技术问题本专利技术的技术方案之一是一种腈水解酶，该腈水解酶是如下(a)或(b)的蛋白质；(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；(b)在蛋白质(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。蛋白质(b)是在蛋白质(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有腈水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。其中，所述的“几个”是指二个至小于100个， 更佳的小于30个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，只要该融合蛋白还是具有腈水解酶活性，本专利技术发现这样的融合蛋白同样可以水解邻氯扁桃腈获得手性(R)-邻氯扁桃酸的腈水解酶，并达到底物耐受性好，产率和ee值较高的效果。也就是说本专利技术发现只要由(a)衍生的蛋白质具有腈水解酶活性，且衍生方式如上所述，则都可以达到本专利技术的专利技术目的。本专利技术所述的腈水解酶来源于Labrenzia aggregate，更佳的来源于Labrenzia aggregate DSM 13394。所述的腈水解酶可以从Labrenzia aggregate中分离获得，也可以从重组表达该腈水解酶的表达子中分离获得，也可以人工合成获得。根据本专利技术，在如SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1_3个氨基酸残基的突变，也可获得上述蛋白质(b)，但仍然保持腈水解酶活性，并催化邻氯扁桃腈水解获得手性(R)-邻氯扁桃酸，例如将SEQ ID No.2第14位的Ile突变为Val，第31位的Glu突变成Gln，第39位的Ile突变为Leu所得的突变蛋白质，其序列如SEQ ID No. 4, 在所述的催化反应中仍然具有底物耐受性好，产率和ee值较高的特点。本专利技术中氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的腈水解酶，与已知腈水解酶的氨基酸序列的同源性低于60%，具有显著性差异。本专利技术所述的腈水解酶可以作为催化剂催化邻氯扁桃腈或其结构类似物水解得到光学纯(R)-邻氯扁桃酸或其结构类似物。本专利技术的技术方案之二是一种腈水解酶基因，所述的腈水解酶基因是如下(1) 或O)的基因(1)其碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；(b)在(a)的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有腈水解酶活性的蛋白质。本专利技术的腈水解酶基因来源于Labrenzia aggregate，更佳的来源于Labrenzia aggregate DSM 13394。所述的腈水解酶基因可以从Labrenzia aggregate基因组中分离获得，也可以从该腈水解酶基因的重组载体中或者重组表达子中分离获得，也可以全人工合成获得。本专利技术所述的腈水解酶基因之一碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，命名为LaN，全长1008bp。其中，其编码序列(⑶幻从第1个碱基起至第1008个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2 所示。更佳地，本专利技术将所述的Labrenzia aggregate DSM 13394的腈水解酶全长基因序列(SEQ ID No. 1)进行1-3个碱基突变，例如将Labrenzia aggregate DSM 13394的腈水解酶基因编码序列的第91位的G突变为C，第501位的C突变T，第636位的A突变成G，从而得到突变的基因，其序列如SEQ ID No. 3所示。该突变基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，仍然具有腈水解酶活性，可以催化邻氯扁桃腈水解获得手性(R)-邻氯扁桃酸。如本领域技术人员所知，本专利技术的腈水解酶基因的碱基序列也可以是编码序列表中SEQ ID似.2(或似.4)所示氨基酸序列的其他任何碱基序列。例如，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No. 2 (或4)的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，张陈胜，潘江，李春秀，张志钧，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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