果糖基肽基氧化酶和用于测定糖化蛋白质的传感器制造技术

公开了来源于芽殖酵母小麦颖枯病菌（Phaeosphaerianodorum）的果糖基肽基氧化酶用于测定样品中的糖化蛋白质的用途。本发明专利技术的果糖基肽基氧化酶具有对果糖基缬氨酸以及果糖基缬氨酰组氨酸的较高的活性，并以较高的灵敏度和特异性用于测定HbA1c。还公开了包含这种酶的电极传感器。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的果糖基肽基氧化酶(FPOX)。更具体地，本专利技术涉及在用于测量糖化蛋白质(glycated proteins)，例如糖化白蛋白、果糖胺、HbAlc、果糖基六肽、果糖基缬氨酸和果糖基缬氨酰组氨酸的试剂盒和传感器中使用的果糖基肽基氧化酶。
技术介绍
糖化的蛋白质通过蛋白质上的氨基和糖的还原端之间的共价键非酶促地产生，并又被称作Amadori化合物。在血液中，葡萄糖在血红蛋白β链的N端结合缬氨酸，从而产生糖化的血红蛋白(糖化血红蛋白(glycohemoglobin^HbAlc)。与正常的健康个体相比，在患有糖尿病的患者中HbAlc与血红蛋白(Hb)的丰度比值较高，且已知血液中的HbAlc浓度反映了在过去几周内的血糖水平。因此血液中的HbAlc浓度在诊断糖尿病的临床检测和在患有糖尿病的患者的血糖控制中非常重要。可使用对果糖基缬氨酸具有特异性的酶测量血液中的HbAlc浓度。果糖基氨基酸氧化酶是FAD依赖性酶，其催化下述反应，其中果糖基氨基酸被氧化，从而生成2-酮基-D-葡萄糖和相应的氨基酸。已经从多种生物中分离出果糖基氨基酸氧化酶，且已表明可使用这样的酶分析糖化蛋白质，例如糖化白蛋白、HbAlc和果糖胺。为了以高特异性测定HbAlc，果糖基氨基酸氧化酶优选地具有对果糖基缬氨酸的选择性(相比果糖基赖氨酸)。更优选地，果糖基氨基酸氧化酶可具有对果糖基缬氨酰组氨酸的氧化酶活性，果糖基缬氨酰组氨酸对应于Hb的N端的2个氨基酸。Hirokawa等人 (Biochem Biophys Res Commun, 311(1)，2003，104-111)公开了来源于 Achaetomiella 和Chaetomius属的丝状细菌的果糖基肽基氧化酶。本专利技术的目的是提供用于测量糖化蛋白质的新的果糖基肽基氧化酶。
技术实现思路
本专利技术是基于具有图1所示的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的来源于小麦颖枯病菌 (.Phaeosphaeria floi/ory )的果糖基肽基氧化酶的发现。在一个方面，本专利技术提供了包含与SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并对果糖基缬氨酰组氨酸具有ImM或更低的Km值的果糖基肽基氧化酶用于测定样品中的糖化蛋白质的用途。 本专利技术还提供了包含与SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并对果糖基缬氨酰组氨酸具有10U/mg · mM或更高的Vmax/Km值的果糖基肽基氧化酶用于测定样品中的糖化蛋白质的用途。本专利技术还提供了包含与SEQ ID N0:1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并且当在50°C热处理10分钟时具有50%或更高的残留活性的果糖基肽基氧化酶用于测定样品中的糖化蛋白质的用途。在另一个方面，本专利技术提供了测定样品中的糖化蛋白质的方法，其包括使样品接触如上定义的果糖基肽基氧化酶，并测量被果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白质的量。在还另一个方面，本专利技术提供了测定HbAlc的方法，其包括消化样品中的HbAlc以产生果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸，使果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸接触如上定义的果糖基肽基氧化酶，并测量被氧化的果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸的量。在还另一个方面，本专利技术提供了测定样品中果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、 果糖基六肽或HbAlc的装置，其包含如上定义的果糖基肽基氧化酶和电子转移介质。优选地，电子转移介质是N，N-双羟乙基-4-亚硝基苯胺。也优选地，所述装置还包含一种或多种选自皂苷、胆红素氧化酶和蛋白酶N的试剂。在另一个方面，本专利技术提供了测定样品中果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、果糖基六肽或HbAlC的试剂盒，其包含如上定义的果糖基肽基氧化酶和电子转移介质。在还另一个方面，本专利技术提供了酶电极，其具有固定在电极上的如上定义的果糖基肽基氧化酶。优选地，使用可光交联的聚乙烯醇树脂将果糖基肽基氧化酶固定在电极上。在还另一个方面，本专利技术提供了测定果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、果糖基六肽或HbAlc的酶传感器，其包含本专利技术的酶电极作为工作电极。附图说明图1显示了来自小麦颖枯病菌的果糖基肽基氧化酶的氨基酸序列。图2显示了果糖基肽基氧化酶的纯化步骤。图3显示了纯化的果糖基肽基氧化酶的SV曲线。图4显示了果糖基肽基氧化酶的热稳定性。图5显示了在m-PMS/DCIP系统中使用果糖基肽基氧化酶测量果糖基缬氨酸。图6显示了使用果糖基肽基氧化酶测量果糖基六肽。图7显示了使用果糖基肽基氧化酶测量HbAlc。图8显示了在H2A系统中使用具有果糖基肽基氧化酶的电极测量果糖基缬氨酸。图9显示了在普鲁士蓝系统中使用具有果糖基肽基氧化酶的电极测量果糖基缬氨酸。图10显示了在亚硝基苯胺(NA)系统中使用具有果糖基肽基氧化酶的电极测量果糖基缬氨酸。图11显示了在m-PMS系统中使用具有果糖基肽基氧化酶的电极测量果糖基缬氨酸。具体实施例方式本专利技术的果糖基肽基氧化酶(PnFPOX)来源于小麦颖枯病菌，并具有图1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO: I).在本专利技术中也可使用具有与SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列至少80%序列同一性的修饰的氨基酸序列的果糖基肽基氧化酶变体。优选地，序列同一性为至少85%，更优选地至少90%，和最优选地至少95%。小麦颖枯病菌的基因组序列已被公开，但此基因还没有被注释。没有迹象或暗示显示小麦颖枯病菌具有果糖基肽基氧化酶或此基因可能编码任意种类的酶。PnFPOX 的氨基酸序列显示了与 FP0X-E (土正青霉(Eupenicillum terrenum)ATCC 18547; GenBank: BAD00185. 1)的 71% 的同一性和与FP0X-C (锥毛壳属物种(Coniochaeta sp. )NISL 9330; GenBank: BAD00186. 1)的74%的同一性。与其他已知果糖基氨基酸氧化酶的序列同源性为约30%。如在下面的实施例中所描述地，PnFPOX显示了对果糖基缬氨酸的更高的活性(相比对果糖基赖氨酸)。其也显示了对果糖基缬氨酰组氨酸的甚至更高的活性。PnFPOX对果糖基缬氨酰组氨酸的Km值是ImM或更低，优选地0. 5mM或更低，和更优选地0. 3mM或更低， 这比FPOX-E和FPOX-C的低约10倍。PnFPOX对果糖基缬氨酰组氨酸的Vmax/Km值是IOU/ mg · mM或更高。此特征在使用此酶以更高的灵敏度和特异性测定HbAlc中特别有利。本专利技术的果糖基肽基氧化酶的另一个有利特征是其热稳定性。当在10 mM PPB (pH 7.0)中在50°C热处理PnFPOXlO分钟时，观察到约75%的残留活性。可使用本领域熟知的技术通过重组表达制备本专利技术的果糖基肽基氧化酶。PnFPOX 的核酸序列可见GenBank: ΧΡ_001798711. 1。可适当地修饰或设计序列，从而在选定的宿主生物中获得更好的表达水平。编码PnFPOX的多核苷酸可从小麦颖枯病菌中克隆，或使用一系列化学合成的寡核苷酸通过PCR制备，或使用自动化DNA合成仪完全合成。将编码PnFPOX的基因插入合适的表达载体，并将载体引入合适的宿主细胞，例如大肠杆菌。培养转化体，并从细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K索德，K伊克布库罗，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，究极酵素国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：