本发明专利技术公开了一种梅花鹿IGF-1成熟肽的基因，并在上游引物5端添加EcoR?I酶切位点和编码Asn的碱基序列，下游引物5端添加Hind?III酶切位点和终止密码子序列，克隆了表达梅花鹿IGF-1成熟肽的碱基序列234bp基因，构建了表达载体pET-32a-IGF-1，在大肠杆菌Rosetta中诱导表达，获得了梅花鹿IGF-1成熟肽。引入EcoR?I、Hind?III酶切位点，在天然的IGF-1前面添加一个Asn，形成一个羟胺的特异裂解部位，降低了蛋白切割成本，减少额外氨基酸序列对蛋白复性的影响，保持蛋白在天然条件下的状态；采用pET-32a作表达载体在大肠杆菌Rosetta中表达，蛋白含量可达菌体可溶蛋白的50％以上，通过MTT法检测，能提高NIH3T3细胞增殖速度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，具体说是梅花鹿IGF-I多肽及其制备方法。
技术介绍
鹿茸是鹿的第二性征，是在鹿额骨部长出的骨质性组织。由于每年周期性地生长，它的生长发育可能受特殊的分子机理调控。即鹿茸的独特之处就在于它的每年更新， 这在哺乳动物中绝无仅有，因而其成为理想的研究组织器官再生的生物模型。鹿茸生长速度之快也是其它任何哺乳动物组织无法比拟的，可达每天l-2cm。因此人们推测其中可能存在特殊的促进骨组织生长的活性物质，能刺激鹿茸的快速生长。胰岛素样生长因子 (insulin-like growthfactor, IGF)是一种多功能细胞增殖调控因子，因其化学结构与胰岛素原类似而得名。其中IGF-I是由70个氨基酸残基组成，具有内分泌、自分泌及旁分泌特性的单链多肽，血液中的IGF-I主要由肝细胞合成和释放。IGF-I在细胞正常生长、胚胎发育、神经生长及能量代谢的方面起着十分重要的作用，其中比较明确的生物学效应主要有两大类，即促进有丝分裂作用和类胰岛素作用。IGF-I是动物生长轴的中心环节，在动物生长调控中起重要作用。Suttie等的研究发现IGF-I与鹿茸的生长率高度相关，生长因子在生茸期鹿血浆中升高，这意味着IGF-I很可能刺激鹿茸生长。Elliott等研究表明，在鹿茸的顶部有大量IGF-I受体，进一步间接证明IGF-I参与了鹿茸生长发育调节的可能性。目前，已从人和许多动物体组织中分离得到IGF-1，如在人、猪、鸡上关于IGF-I促进生长的研究较多。但是，类似东北梅花鹿IGF-I成熟肽的表达与活性研究在国内外比较少。目前，人IGF-l(hlGF-l)在临床上已用于治疗糖尿病、胰岛素抵综合征、侏儒症及神经系统疾病等多种疾病，并取得了良好的效果。国内外已有通过哺乳动物细胞及大肠杆菌表达获得hIGF-Ι的报道，但存在表达量较低和纯化较困难等问题。本专利技术人根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGFl基因特异引物并克隆 IGFl基因，将梅花鹿IGFl基因DNA序列已递交GenBank，并利用相对荧光定量Real-time PCR法检测IGFl在鹿茸顶端不同部位组织的转录表达丰度。成功获得了梅花鹿鹿茸组织 IGFI基因全长编码区cDNA (GenBank登录号为HQ890468)，该基因长465bp，编码154aa长度的多肽，与马鹿、牛、羊、马、猪、人和小鼠IGFl基因进行同源性分析显示，IGFl基因与马鹿、牛和羊同源性最高，核苷酸序列分别为99. 78%,98. 28%和97. 85% ;氨基酸序列分别为99. 35 %、98· 05%和97. 40 %。相对荧光定量PCR差异分析发现，IGFl基因在鹿茸顶端不同部位组织均有表达。其中，在前软骨和软骨组织的表达水平明显高于真皮和间充质组织(见《东北林业大学学报》2011第39卷第11期，梅花鹿IGFl全长cDNA克隆及在鹿茸组织的表达)。pET系列载体是目前原核表达中，应用较为广泛的表达系统。pET系列载体中连有 T7噬菌体转录系统，其mRNA的合成速度是大肠杆菌的5倍，进而实现目的蛋白的高效表达。 其中，pET-32a载体含有一个硫氧还蛋白的碱基序列，连接目的片段后，以融合蛋白的方式与目的蛋白一同表达，不但可以促进目的蛋白二硫键的形成，使目的蛋白恢复正确的三维结构，而且还可以保护目的蛋白免受大肠杆菌细胞内蛋白酶的降解。此外，该载体中还含有组氨酸标签，能够特异地与钴或镍等金属离子结合，提高蛋白纯化效率。尽管pET_32a表达产物中含有肠激酶和凝血酶的特异切割位点，但是酶试剂价格昂贵，不利于工业化生产，而且切割后目的蛋白上游会带有十几个到几十个额外的氨基酸序列，对于小分子量蛋白的复性影响很大，直接影响蛋白活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种梅花鹿IGF-I成熟肽的基因、成熟肽及其梅花IGF-I成熟肽制备方法。梅花鹿IGF-I成熟肽的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. I所示；梅花鹿IGF-I成熟肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。梅花IGF-I成熟肽的制备方法，该方法包括I)用引物PI:TTCGAATTCAACGGACCCGAGACCCTCTGP2 CGCAAGCTTCTAGGCCGCCTTGGTGG ；提取梅花鹿鹿茸组织的总RNA，反转录成双链cDNA，为模板扩增；2)扩增产物插入表达载体pET_32a中，获得表达载体pET-32a-IGF_l，将其转染大肠杆菌Rosetta感受态细胞中；IPTG诱导表达；收集纯化融合蛋白；3)用羟胺裂解液裂解融合蛋白，蛋白复性液复性，去杂，得梅花IGF-I成熟肽；所述的IPTG诱导表达为浓度为O. 6mmol/L的IPTG诱导，表达4小时；所述的羟胺裂解液为2mol/L 羟胺，200mmol/L CHES，8mol/L 尿素，pH9. 5 ；所述的蛋白复性液为O. 5mmol/L NaCl, Immol /T, EDTA, 20mmol/L Tris-HCl, I % Gly,lmmol/LGSH,3mmol/L GSSG, pH 8.0。本专利技术提供了一种梅花鹿IGF-I成熟肽的基因，并在上游引物5端添加EcoRI酶切位点和编码Asn的碱基序列，下游引物5’端添加Hind III酶切位点和终止密码子序列， 克隆了表达梅花鹿IGF-I成熟肽的碱基序列234bp基因，构建了表达载体pET-32a-IGF-l， 在大肠杆菌Rosetta中诱导表达，获得了梅花鹿IGF-I成熟肽。引入EcoRI、Hind III酶切位点，利用梅花鹿IGF-I第一个氨基酸为Gly的特点，在天然的IGF-I前面添加一个Asn，形成一个羟胺的特异裂解部位(Asn-Gly肽键)，降低了蛋白切割成本，减少额外氨基酸序列对蛋白复性的影响，保持蛋白在天然条件下的状态；采用pET-32a作表达载体在大肠杆菌 Rosetta中表达，蛋白含量可达菌体可溶蛋白的50%以上，通过MTT法检测显示，随着IGF-I 浓度的增加，NIH3T3细胞增殖速度呈递增趋势，在Ong/ml 200ng/ml之间呈现浓度依赖性，通过流式细胞仪对细胞周期分析发现，与未经IGF-I处理的细胞比较，Gtl期和G1期细胞数有所减少，S期细胞数有所增加，证明梅花鹿IGF-I对鹿茸的快速生长具有重要的作用， IGFl与鹿茸的再生存在密切的关系。附图说明图I 为 IGF-I 基因 PCR 扩增产物的检测，I. DNA Marker (DL2000) ;2，3. PCR 产物。图2pET32a-IGF-l 表达产物的 SDS-PAGE 电泳分析，1-6.分别为 O. 1,0. 2,0. 4,O. 6,0. 8,1.0mmol/L IPTG诱导的表达产物；7.未诱导的pET32a_IGF_l ；8.蛋白质相对分子量标准。图3pET32a-IGF_l裂解及纯化产物的SDS-PAGE电泳分析，I.蛋白质相对分子量标准；2.羟胺裂解产物；3.纯化产物。图4IGF-1处理48h后NIH3T3细胞周期变化分析。图5未经IGF-I处理的NIH3T3细胞周期变化分析。具体实施例方式实施例I梅花鹿IGF-I成熟肽基因的克隆提取梅花鹿(来自吉林农业大学试验鹿场)鹿茸组织的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡薇，孟星宇，李婷，李沐，胡锐，王健，李雨婷，田玉华，刘宁，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：
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