本发明专利技术涉及的是玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒及检测方法，这种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒包含2套PCR反应体系，第一套反应体系包括由二条特异性引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:3组成的第一对引物对，第二套反应体系包括由二条特异引物SEQIDNO:2和SEQIDNO:3组成的第二对引物对。本发明专利技术根据玉米弯孢叶斑病菌clg2p基因设计特异扩增引物，并构建玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒，应用于玉米弯孢叶斑病菌的分子检测，可准确、快速对玉米弯孢叶斑病原菌的分子鉴定，也可以用于叶斑型和坏死型等症状的玉米病苗是否由玉米弯孢叶斑病菌侵染所致，将在玉米弯孢叶斑病菌病原的鉴定和病害的田间监测中具有重大的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是生物
中真菌病害检测技术，具体涉及的是玉米弯孢叶斑病菌 PCR检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
玉米弯孢菌叶斑病是由玉米弯孢菌(Curvularia lunata (Wakker) Boed)引起的,在世界的大部分国家造成过重大危害。1996年,该病在中国造成严重的玉米损失,40%玉米产区被该病侵染。该病原主要危害玉米叶片，也可危害叶鞘和苞叶。病斑初为水浸状或淡黄色半透明小点，之后扩大为圆形、椭圆形、梭形或长条形病斑，病斑形状和大小因品种抗性分为3类①抗病型病斑(R):病斑小，f 2mm，圆形、椭圆形或不规则形，中央苍白色或淡褐色，边缘无褐色环带或环带很细，最外围具狭细的半透明晕圈；②中间型病斑(M):病斑小， f 2mm，圆形、椭圆形、长条形或不规则形，中央苍白色或淡褐色，边缘有较明显的褐色环带， 最外围具明显的褪绿晕圈；③感病型病斑(S):病斑较大,长2 5mm,宽2mm,圆形、椭圆形、 长条形或不规则形，中央苍白色或黄褐色有较宽的褐色环带，最外围具较宽的半透明黄色晕圈，有时多个斑点可沿叶脉纵向汇合而形成大斑，最大的可达10_，甚至整叶枯死。潮湿条件下，病斑正反两面均可产生灰黑色霉状物，即病原菌的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗单生或数根丛生，暗褐色，不分枝，有隔，顶部多呈屈膝状，大小7(T270 umX2^4um,顶端和侧面着生分生孢子。分生孢子淡褐色、灰褐色，棍棒形或椭圆形，少数呈“Y”型，向一端弯曲，多数分生孢子为3个隔膜4个细胞结构，中间两个细胞膨大，暗褐色，从基部向上数第三个细胞最大，两端细胞较小，大小为I扩30 u mX8^19 u m,淡褐色，呈新月型。目前在鉴定玉米弯孢叶斑病菌和由该病原所引起的病害主要是通过病原的分生孢子，分生孢子梗和在寄主上产生的病斑类型。上述的鉴定方法费时、费事，并且鉴定准确性不高。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒用于解决现有的对玉米弯孢叶斑病菌检测和鉴定方法耗时长、不能及时监测和控制病原菌的传播的问题；本专利技术的另一个目的是提供玉米弯孢叶斑病菌PCR检测方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是这种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒包含2套PCR反应体系，第一套反应体系包括由二条特异性引物SEQ ID NO: I和SEQ ID N0:3组成的第一对引物对，第二套反应体系包括由二条特异引物SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:3组成的第二对引物对，二对引物对引物序列和组合方式如下第一对上游引物 5'-ACGGAGGATGCGGTATGG-3' (SEQ ID NO: I)下游引物 5'-CCTCGGAATCGTGCITTT-3' (SEQ ID N0:3)第二对上游引物 5' -GGGGCTCGCAGGCTAATGT-3' (SEQ ID NO: 2)下游引物 5'-CCTCGGAATCGTGCITTT-3' (SEQ ID N0:3)上述方案中每套反应体系还包含PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq酶。上述方案中第一套反应体系由以下组分组成以Iml溶液计，100W 10XPCR反应缓冲液，20 m浓度为IOmM的dNTP，200单位Taq酶，浓度为IOmM IOmM的第一对上、 下游引物各40 W，余量为超纯水。上述方案中第二套反应体系由以下组分组成以Iml溶液计，100W 10XPCR反应缓冲液，20 m浓度为IOmM的dNTP，200单位Taq酶，浓度为IOmM IOmM的第二对上、 下游引物各40 W，余量为超纯水。上述方案中检测试剂盒还包括有说明书。一种上述玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒PCR的检测方法，一、用PCR检测试剂盒中第一套PCR反应体系，对样品进行第一次PCR扩增，获得PCR 扩增产物；二、取测定步骤一获得的PCR扩增扩物用无菌水按I:50稀释，然后取I微升稀释产物作为扩增模板，以上述的PCR检测试剂盒中的第二套PCR反应体系，对所述样品进行第二次 PCR扩增，获得PCR扩增产物；若产物中存在827bp的DNA片段，则表明所述样品中有玉米弯孢叶斑病菌。上述方案中样品是病原菌的分子孢子和病原菌菌丝的DNA提取物。上述方案中样品是玉米叶片组织的DNA提取物。一种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测方法，该检测方法包括使用二对特异性引物对， 其中第一对引物对由二条特异性引物SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:3组成，其中第一对引物对由二条特异性引物SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:3组成，其引物序列和组合方式如下第一对上游引物 5'-ACGGAGGATGCGGTATGG-3' (SEQ ID NO: I)下游引物 5'-CCTCGGAATCGTGCITTT-3' (SEQ ID N0:3)第二对上游引物 5' -GGGGCTCGCAGGCTAATGT-3' (SEQ ID NO: 2)下游引物 5'-CCTCGGAATCGTGCITTT-3' (SEQ ID N0:3)有益效果I、本专利技术根据玉米弯孢叶斑病菌clg2p基因设计特异扩增引物，并构建玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒，应用于玉米弯孢叶斑病菌的分子检测。本试剂盒可准确、快速对玉米弯孢叶斑病原菌的分子鉴定，也可以用于叶斑型和坏死型等症状的玉米病苗是否由玉米弯孢叶斑病菌侵染所致，将在玉米弯孢叶斑病菌病原的鉴定和病害的田间监测中具有重大的应用前景。2、准确性高本专利技术根据玉米弯孢叶斑病菌clg2p的特异位点设计引物，能够有效扩增该基因的特异片段，通过对弯孢属的其它种和相关的其它真菌、植物体和细菌菌株的DNA的扩增，结果发现本专利技术只有玉米弯孢叶斑病菌中才能扩增到片段，其检测方法准确率100%。3、灵敏度高传统的玉米弯孢叶斑病是通过病原产生的分生孢子，分生孢子梗和病害在寄主上产生的病斑类型进行鉴定，需要通过病原的分离、纯化和复杂的接种试验。在其过程需要病原物产生足够多的菌丝和分生孢子才能鉴定出来。本专利技术提供的检测试剂盒及检测方法能检测到lOfg/W的DNA，可以说其灵敏度相当高。4、实用强玉米是世界重要的粮食作物，当前玉米弯孢叶斑病是一种世界性病害，在泰国、意大利、南斯拉夫、罗马尼亚、土耳其、墨西哥、匈牙利、澳大利亚、巴西和美国等国均有分布，给玉米产量带来了极大的损失。玉米弯孢叶斑病菌的快速检测将对病菌的田间监测和病害流行预测预报提供重要的依据，将具有重要的实际应用价值。四附图说明图I显示了本专利技术实施例I中对玉米弯孢叶斑病菌的检测结果，图中泳道M为标准分子量大小，泳道I 一 8为玉米弯孢叶斑病菌菌丝体；泳道9 一 15其它病原菌。图2显示了在本专利技术中对玉米弯孢叶斑病菌检测的敏感性结果，图中泳道M为标准分子量大小，泳道I-8的基因组浓度分别为100 ng/m, 10 ng/m, I ng/m, 100 pg/ Ml, 10 pg/Ml, I pg/Ml, 100 fg/Ml, and 10 fg/Ml,泳道 9 为阴性对照。五具体实施例方式这种玉米弯孢叶斑病菌PCR检测试剂盒包含2套PCR反应体系及说明书，第一套反应体系由以下组分组成以Iml溶液计，IOOW 10XPCR反应缓冲液，20 W浓度为IOmM的 dN本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘铜，侯巨梅，左豫虎，慕庆峰，马柄辰，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：
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