本发明专利技术公开了一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白、编码基因及其应用。本发明专利技术的慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白是在慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2蛋白的氨基酸序列第318位谷氨酸突变为天冬氨酸，同时得到了该突变蛋白的编码基因，建立了基于C2基因及其突变体的诊断试剂盒，该试剂盒可以对临床上慢性乙肝患者进行基因水平的诊断，还可以对其临床用药情况予以指导和个体化治疗。从长远看，对慢性乙型病毒性肝炎进行C2基因的突变检测使我们有可能在今后通过纠正突变的基因疗法或其它针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病，在临床治疗方面有深远意义和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程及医学
，具体涉及ー种慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白、编码基因及其应用。
技术介绍
慢性乙型病毒性肝炎(慢性乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染而引起的以肝脏损害为主要表现的传染性疾病，是关系到我国乃至全球公共卫生的重大疾病。宿主的遗传背景在其易感性及免疫应答中起重要作用。而人群对乙肝免疫力的高低存在明显的个体差已升。中国专利200810004159. 5公开了ー种与肝細胞癌相关的乙型肝炎病毒基因组标志物以及预测HBV感染个体发展成肝細胞癌(HCC)的遗传素因的试剂盒。该试剂盒包括一种或更多种探针，当其与HBV基因组接触吋，如果所述基因组为C 基因型、且包括至少ー种对应于某段核苷酸序列上的核苷酸(170C;和/或2170G2;和/或M41C;和/或799G)时会选择性地与所述基因组杂交。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白。本专利技术的另一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白的编码基因。本专利技术的又一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因C 的突变蛋白、该突变蛋白的编码基因的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的ー种慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白，是在慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2蛋白的氨基酸序列第318位谷氨酸Glu突变为天冬氨酸Asp，本专利技术中用p. Glu318Asp表示。上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因β 的突变蛋白，氨基酸序列如SEQ ID Ν0:1所示上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白的编码基因。该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO: 2所示。慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。慢性乙型病毒性肝炎相关基因C2的突变蛋白的编码基因在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。ー种慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，由以下成分組成核苷酸序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的引物，PCR反应液，PCR产物纯化盒和测序反应液；以上成分可以使用本领域常规试剂盒用量及浓度。所述PCR反应液为溶解了 I1ag DNA聚合酶、dNTPs、镁离子(如MgCl2)、PCR反应缓冲液(如IOXTaq Buffer)，上述试剂均可购买相应商品，如IOmM dNIPs购自上海生エ生物エ 程技术服务有限公司；Tag DNA聚合酶及其配套的IOXTaq Buffer、MgCl2购自！^ermentas 公司。各试剂的用量及浓度均为本领域常规值，如Iu/ μ L Tag DNA聚合酶1 μ L、2mmol/L 的 dNTP (即浓度均为 2mmol/L 的 4 种 dNTP 的混合物)3 μ L、25mmol/L MgCl2 3 μ L、10 X Taq Buffer (内含(NH4)2SO4) 3 μ L、灭菌 ddH20 17yL。所述PCR产物纯化盒为纯化PCR产物的溶液和DNA吸附柱Labell ；所述纯化PCR 产物的溶液为lu/ μ L虾碱性磷酸酶(SAP，可购于!^ermentas公司)0. 6 μ L、20u/ μ L外切酶(位ο I，可购于Fermentas公司)0. 15 μ L和灭菌ddH20 1. 25-1. 75 μ L，或按上述比例配制的其他体积的混合液。纯化PCR产物的溶液优选2-2. 5 μし所述测序反应液为IyL的BigDye (购自ABI公司)和2μ L的5Xkquence buffer (购自ABI公司)的混合液，BigDye和5Xkquence buffer的体积比优选为1:2，如 1 μ LBigDye 与 2 μ L 5 X Sequence buffer t昆合 0上述慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，优选核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示的引物浓度分别为3.2ymol/L0本专利技术的慢性乙型病毒性肝炎的相关基因β 及其突变p. Glu318Asp，是通过对 “相对极端性状的”50例慢性乙肝患者及40例未注射过乙肝疫苗正常对照进行全基因组外显子测序，通过生物信息学分析及进ー步的数据筛选找到最有可能的候选基因；然后再对所找到的候选基因进行大样本量的病例-対照(其中慢性乙肝患者17 例，未注射乙肝疫苗正常对照1636例)相关关系研究；最后通过相关基因的作用机理及统计学分析结果(C 基因突变与慢性乙肝相关的统计学/7值为2. 78Χ10_4，优势比(OR)为1. 97，说明两者有显著相关性)最终确定了ぴ基因突变与慢性乙型肝炎相关。本专利技术的人C 基因核苷酸全长序列(包含突变位点)通常是用聚合酶链式反应 (PCR)进行合成。对于PCR扩增法，可根据C 基因的核苷酸序列，进行引物设计，并以所检测的患慢性乙型肝炎患者抽提的DNA作为模板，扩增目的序列。最后通过测序反应检测及确定相关基因的突变。由于前期的研究已经证明了慢性乙型肝炎与C 基因突变的高度相关性，因此检测这个基因的突变可用于鉴定慢性乙型肝炎患者的宿主遗传背景的易感性及对免疫应答的反应能力，进ー步地用于之后靶向个体化治疗。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果我们通过全基因组外显子测序及大样本量的相关研究，发现了与慢性乙型病毒性肝炎的相关基因——C2及其突变。因此，找寻及检测慢性乙肝相关基因及其突变，不仅是了解及阐明本病的发病机理的必要途径，同时也为建立鉴定本病的基因诊断和个体化治疗提供了新的契机。在已了解与本病相关的C 基因及其突变之后，我们可以建立起基于C 基因及其变异的诊断技术，以期对临床上慢性乙肝患者进行基因水平的诊断，还可以对其临床用药情况予以指导和个体化治疗。由于基因的突变是导致本病遗传背景发生改变从而致使其易感性及免疫应答发生改变的重要因素，从长远看，对本病进行C2基因的突变检测使我们有可能在今后通过纠正突变的基因疗法或其它针对这ー突变的生物学效应的方法去治疗本病。因此，从长远看，与本病相关的C2基因突变的发现在临床治疗方面有深远的意义和前景。附图说明图1 基因的部分测序结果，图中上部为C 野生型的测序結果，中部为C p. Glu318Asp杂合性突变的测序结果(箭头所示为突变位点)，图中下部为C2 p. Glu318Asp 纯合性突变的测序结果(箭头所示为突变位点)。具体实施例方式以下实施例中如无特殊说明均为本领域常规试剂和试验方法。实施例1病例收集来自中山大学附属第三医院传染科的17 例慢性乙型肝炎患者和来自同一地区的1636例未注射乙肝疫苗或自报疫苗注射史不明的健康自愿者，在取得上述患者、自愿者及家属知情同意后，取外周血于EDTA抗凝管中备用。用Qiagen公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kits (试剂盒)从抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，-80°C保存，备用。实施例2 C2基因的突变检测C 基因的mRNA序列来自Genbank (NM_000063)。Genomic DNA序列来自UCSC数据库 (http://genome, ucsc. eau/J 禾ロ Ensemol 数据ノ车(http://asia. ensembl. org/index, html)。主要步本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王一鸣，黄玮俊，彭亮，赵强，李奇斌，裴元元，袁萍，高志良，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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