本发明专利技术属于食品工业生物技术领域，涉及一种利用枯草杆菌高效生产重组脂肪氧合酶的方法。该方法包括如下步骤：(1)构建鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌；(2)将所述的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌接种于装液量为58-63mL/250mL的加入15-18g/L乳糖的LB培养基中，27-30℃、180rpm条件下培养85-90h，离心收集上清液。在该最佳条件下，重组脂肪氧合酶活达到167.32U/mL，为其大规模的生产提供一定的指导。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品工业生物
，涉及。
技术介绍
脂肪氧合酶(Lipoxygenase，ECl. 13. 11. 12)，简称脂氧酶，属氧化还原酶，可催化含顺-顺-1，4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸等)及酯形成氢过氧化物， 生成的不稳定氢过氧化物能氧化面筋蛋白质形成二硫键，使蛋白质分子聚合，从而达到增强面筋的作用。脂氧酶还可以通过偶合反应破坏类胡萝卜素的双键结构，使得面粉漂白。因此，脂氧酶兼具面粉强筋和增白的功效，可以减少或替代化学强筋剂溴酸钾及化学漂白剂过氧化苯甲酰的使用，降低其对人体健康的危害。但由于目前脂氧酶主要从动植物组织中分离提取获得，产量低、纯度不够是制约其大规模应用的主要原因。脂氧酶的分离提取、结构分析和酶学性质研究是目前国内外学者的主要研究方向。对于如何实现脂氧酶的高效生产和工业化应用，目前国内相关研究甚少。食品用酶属于大宗工业产品，下游一般采用低成本的分离提取手段，不能保证诸如大肠杆菌热源物质完全去除；如果采用复杂的纯化方法，则成本就成为应用的限制性因素。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，是传统的工业生产菌，分泌蛋白能力强，细胞壁结构简单且不含内毒素，美国FDA将其列为GRAS (GeneralIy Recognized As Safe)级别的微生物。枯草杆菌表达系统已被成功地用于多种蛋白的表达，大部分是具有工业应用价值的酶， 尤其是蛋白酶和淀粉酶。虽然关于外源蛋白表达的研究枯草杆菌还远远落后于大肠杆菌， 但是在表达和分泌活性蛋白方面则明显优于大肠杆菌，在食品基因工程研究中更具有大肠杆菌无法比拟的优越性。近年来关于枯草杆菌应用于食品基因工程的研究，越来越受到重视。随着分子生物学和基因工程的飞速发展，有理由相信枯草杆菌表达系统将更加完善，成为原核蛋白表达的最佳宿主之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现一种利用枯草杆菌生产重组脂肪氧合酶的方法，包括如下步骤(1)构建含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌；(2)将所述的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌接种于装液量为 58-63mL/250mL (表示每250ml三角瓶装液58_63mL)的加入15_18g/L乳糖的LB培养基中， 27-300C、180rpm条件下培养85_90h，离心收集上清液。其中，步骤(1)构建含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌的方法为I.克隆鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX，其序列为SEQ ID NO. 1 ；II.鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX与分泌表达载体pHBSR连接得到 pHBSR-ana-LOX组成型重组表达载体；III. pHBSR-ana-LOX组成型重组表达载体电转化枯草杆菌宿主WB800得到含有鱼腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的鱼腥藻脂肪氧合酶重组枯草杆菌基因工程菌。所述的分泌表达载体pHPSB通过如下方法构建i.构建载体 pHB-hc 合成一对引物 Pl :SEQ ID NO. 2/P2 =SEQ ID NO. 3，退火使之可以配对形成双链，两端形成Clal、XhoI的粘性末端；将退火双链产物与PHB201先后经 ClaKHindIII酶切得到的5. 4kb大片段连接，得到载体pHB_hc ； 构建载体pHP43 以枯草芽孢杆菌168 (Invitrogen)基因组为模板，P43-F =SEQ ID NO. 4/P43-R =SEQ ID NO. 5为引物，PCR扩增获得P43启动子，P43启动子经Xhol/Clal 双酶切后插入经同样双酶切的载体pHB-hc中，得到载体pHP43 ；iii.构建载体pHP43R 以枯草杆菌168基因组为模板，P3 =SEQ ID NO. 6/P4 =SEQ ID NO. 7，为引物，PCR扩增获得枯草杆菌淀粉酶E启动子基因PamyE;以枯草杆菌168基因组为模板，P5 =SEQ ID NO. 8/P6 =SEQ ID NO. 9，为引物，PCR扩增获得枯草杆菌分子伴侣 Sec分泌途径分子伴侣I^rsA ；以P3为上游引物，以P6为下游引物，以PCR反应产物PamyE 和基因片段混合物为模板，利用PCR的方法扩增获得启动子PamyE介导的表达的表达框PamyE-PrsA ；载体pHP43用ClaI酶切后用去磷酸化酶处理，与经ClaI酶切的 PamyE-PrsA片段经T4连接酶连接获得载体pHP43R ；iv.构建分泌表达载体pHBSR 以 SnprB-F :SEQ ID NO. 10/SnprB-R :SEQ ID NO. 11 为引物，以枯草杆菌168基因组DNA为模板PCR扩增SnprB信号肽，通过EcoRI/BamHI双酶切反应获得SnprB信号肽基因，与同样双酶切处理的pHP43R载体通过T4DNA酶连接获得分泌表达载体pHBSR。步骤O)中加入的乳糖终浓度为16 17g/L，优选加入的乳糖终浓度为16. 9g/L。步骤O)中发酵温度为28 30°C，优选发酵温度为29. 71°C。步骤O)中发酵时间为87 89h，优选发酵时间为88. 49h。有益效果脂肪氧合酶在食品加工中，具有重要的应用价值，如强筋、漂白，此外可以应用于风味物质的合成过程。目前，脂肪氧合酶还未实现真正的商业化应用，这是由于从天然材料中分离纯化成本过高，而基因工程菌研究也仍处于初期，且主要以大肠杆菌宿主为主。而大肠杆菌是一种不安全的宿主，不适合应用于食品领域。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌， 是传统的工业生产菌，分泌蛋白能力强，细胞壁结构简单且不含内毒素，美国FDA将其列为 GRAS (Generally Recognized As Safe)级别的微生物。然而目前还未见枯草芽孢杆菌表达脂肪氧合酶的报道。本专利技术构建了一种新型的枯草杆菌分泌表达载体，利用本专利技术构建的载体，将克隆获得的鱼腥藻基因组中的功能性LOX基因，实现了在枯草杆菌的高活性重组表达。在此基础上，进一步利用高效分泌表达重组脂肪氧合酶的pHBSR-ana-LOX组成型重组表达载体构建鱼腥藻脂肪氧合酶基因工程菌，采用Plackett-Burman设计法从影响重组菌发酵产脂氧酶的相关因素中筛选出显著影响因子，并采用响应面中心组合设计法(Central Composite Design)研究显著影响因子的交互作用并确定各因子的最佳组合，寻找到基因工程菌发酵产酶的最佳条件，在该最佳条件下，重组酶产量(酶活)达到167. 32U/mL，为其大规模的生产提供一定的指导。附图说明图1载体pHB-hc的获得图2载体pHP43的获得图3载体pHP43R的获得图4载体pHBSR的获得图5P1、P2退火双链产物示意6重组鱼腥藻脂肪氧合酶表达载体构建过程图7影响重组枯草杆菌生产脂氧酶因素间交互作用的3D图具体实施例方式实施例1鱼腥藻(Anabaena sp. PCC 7120)脂肪氧合酶基因克隆离心收集鱼腥藻(Anabaena sp. PCC 7120)菌体，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取鱼腥藻本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，张充，吕凤霞，章栋梁，别小妹，王昱沣，赵海珍，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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