本发明专利技术公开了一种杨树单倍体的培育方法，属于杨树单倍体的选育领域。所述培育方法包括：1)将消毒处理后的杨树花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得杨树愈伤组织；2)将愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养，获得杨树不定芽；3)将不定芽接种于生根培养基上进行生根培养，获得试管小苗；4)经过倍性鉴定，获得杨树单倍体植株。本发明专利技术杨树单倍体的培育方法解决了杨树单倍体培育中所存在的问题，愈伤组织诱导率高，愈伤组织器官分化率高，繁殖率高，诱导繁殖操作步骤简单，可以在短期内形成大量优良的杨树试管苗，可进行规模化、工厂化生产，为杨树的育种、品质改良、遗传研究等提供了物质基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单倍体植物的培育方法，特别涉及一种采用植物组织培养获得杨树单倍体的培育方法，属于杨树单倍体的选育领域。
技术介绍
北京杨(Populus beijingensis)为青杨和钻天杨的杂交后代，是新中国成立后林业界第一次用人工杂交育种方法育成的杨树新品种，其具有耐寒、喜水肥、树态美等特点， 是优良的用材林、防护林、行道树和“四旁”绿化树种，主要分布于中国的华北和西北等地区，深受群众喜爱。杨属植物是雌雄异株，自花授粉基本上是不可能实现的。通过常规的杂交育种获得纯合的株系需要很长的育种周期。为了获得纯合的杨树株系，研究者以往采用自花授粉或是回交的方法，但是这一育种过程需要的育种年限很长。通过花药培养则可以先获得目标株系的单倍体，后将其进行加倍成为双单倍体(doubled haploids, DHs)，这样就明显的缩短育种周期。此外，随着现代生物分子技术的迅速发展，植物单倍体及其产物已经在倍性育种、基因组测序、图谱构建和功能基因的发掘与鉴定等多方面成功应用并取得了很大的成果，单倍体植物材料及其产物为越来越多的研究者所青睐。目前，植物单倍体的诱导途径包括花药和花粉培养、孤雌生殖、染色体消除等，其中花药培养是获得植物单倍体的一种较为有效的技术。在离体条件下，用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过器官分化的途径，获得完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供了有效地手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经过自发加倍或人工诱导加倍，获得纯和二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用的材料。利用花药花粉培养获得单倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种、人工诱变育种、远缘杂交等方法结合，用以克服这些方法中的不足，也可以直接用此方法创造新的类型。但是，以杨树花药为外植体选育杨树单倍体的培养过程中一直存在愈伤组织诱导率低、愈伤组织器官分化率低等问题，导致现有的杨树单倍体的培育方法远远不能满足研究和生产实践的需求，亟待改进。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对现有的杨树单倍体的培育方法中所存在的不足，提供一种新的杨树单倍体的培育方法，该方法的杨树花药愈伤组织诱导率高、愈伤组织的器官分化率和不定芽的生根率高，可以在较短时间内形成大量优良的杨树单倍体试管苗，可进行规模化、工厂化生产。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案一种杨树单倍体的培育方法，包括1)将消毒处理后的杨树花药接种在愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，获得杨树愈伤组织；2)将杨树愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养，获得杨树不定芽；3)将杨树不定芽接种于生根培养基上进行生根培养，获得试管小苗；4)经过倍性鉴定，获得杨树单倍体植株。其中，所述的杨树优选为北京杨(Populus beijingensis)。为了达到更好的培育效果，当杨树花序的小孢子发育时期处于单核靠边期时，此时将其中的花药取出进行愈伤组织的诱导培养，能有效的提高愈伤组织的诱导培养率；其中，杨树小孢子发育时期可以通过观察花芽的形态和直径粗略判断小孢子的发育时期。较为有效的检测方法是染色观察小孢子的发育阶段，这些方法或手段均为本领域技术人员所通晓；本专利技术通过醋酸洋红染色观察来确定小孢子的发育时期。由于杨树花为柔荑花序，花芽表面的鳞片微被毡毛，步骤1)中所述消毒处理采用如下处理方式具有更好的无菌效果1-A)用毛笔轻刷花芽鳞片表面后用无菌水冲洗花芽；1-B)用酒精浸泡花芽；1-C)用次氯酸钠溶液对花芽进行表面灭菌，用无菌水冲洗；1-D)吸干花芽表面水分后从花序取出花药，即得。优选地，步骤1-A)中无菌水冲洗次数为4-5次；步骤1-B)中所述酒精的体积百分比浓度为70. 0% ；浸泡时间为30s ；步骤1-C)中次氯酸钠的质量百分比浓度为7. 0% ；表面灭菌时间为5min ；无菌水冲洗次数为3-5次。步骤1)中所述愈伤组织诱导培养基优选是H基本培养基+奈乙酸 (NAA)O. 5-1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤(KT)O. 5-1. Omg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 5. 5g/L ；更优选为 H基本培养基+奈乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5-1. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂5. 5g/L ；最优选为H基本培养基+奈乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤1. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂5. 5g/ L ；进一步优选的，步骤1)中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行黑暗条件下，培养温度为25 士 1°C ；步骤幻中所述不定芽分化培养基优选是MS培养基+6-苄基腺嘌呤(BAP)O. 6mg/ L+ 奈乙酸(NAA)0. 2mg/L+ 赤霉素(GA3)0. 02-0. 2mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5. 5g/L ；更优选为MS培养基+6-苄基腺嘌呤0. 6mg/L+奈乙酸0. 2mg/L+赤霉素0. 02mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5. 5g/L ；进一步优选的，步骤2、中所述不定芽分化培养在以下条件下进行培养温度为 25士 1°C，光照1500 20001x，光照时间16小时/天；步骤3)中所述生根培养基优选是1/2MS培养基+吲哚丁酸(IBA)O. 2-0. 5mg/ L+蔗糖20g/L+琼脂5. 5g/L ；更优选为:1/2MS培养基+吲哚丁酸0. 3mg/L+蔗糖20g/L+ 琼脂5. 5g/L ；进一步优选的，步骤幻中所述生根培养在以下条件下进行培养室温度为 25士 1°C，光照1500 20001x，光照时间16小时/天。本专利技术杨树单倍体培育方法利用杨树花药经过诱导愈伤组织后再器官分化为植株，从而获得杨树单倍体植株。为了提高培养过程中愈伤组织诱导率、愈伤组织器官分化率及生根率等问题，本专利技术对愈伤组织诱导培养基、不定芽器官分化培养剂以及生根培养基的配方进行了优化，最终筛选得到了不同培养阶段的最适宜的培养基组成，显著的提高了愈伤组织诱导率、愈伤组织器官分化率及生根率，最终提高了杨树单倍体的得率，为杨树的育种、品质改良、遗传研究等提供了物质基础。本专利技术方法培育的杨树单倍体植株生长健壮、繁殖系数高，获得试管小苗移栽成活率高达92.0%，是工厂化大规模生产北京杨植株的简便、快捷的技术体系。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1一、试验材料1、供试材料北京杨(Populus beijingensis)；2、植物生长调节剂本专利技术中所使用的植物生长调节物质采用国产萘乙酸(NAA)、6_苄氨基腺嘌呤 (BAP)、6-糠氨基嘌呤(KT)、赤霉素(GA3)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4_D)、吲哚丁酸(IBA)。3、培养基的配制(1) "MS基本培养基”的组成及配制方法表1 MS 培养基(Murashige and Skoog, 1962)母液种类成分名称浓度(mg/L)母液种类成分本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：安新民，李英，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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