墨兰光周期相关基因CsCOL1及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种墨兰光周期相关基因CsCOL1及其应用。CsCOL1基因其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第40位到1020位碱基所示，及其编码蛋白其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示和含有CsCOL1基因的重组植物表达载体，还有CsCOL1基因在缩短植物童期，促进植物开花中的应用。本发明专利技术首次从墨兰中克隆的CONSTANS-like基因-CsCOL1基因，并且通过实验证明该基因能够影响植物生长发育进程，促使植物提前开花。因此，本发明专利技术提供的墨兰CsCOL1基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体涉及一种在墨兰中表达的，与光周期相关的CONSTANS-Iike基因-CsCOLl基因及其编码蛋白、含有该基因的重组植物表达载体和CsCOLl基因在促进植物生长发育上的应用。
技术介绍
日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要因素之一。拟南芥是一种典型的长日照植物，长日照能促进拟南芥开花，而短日照则会抑制开花。目前的研究发现，光周期途径中的主要调控基因有CONSTANS(CO)，CRY2/FHA, GIGANTEA (GI)，FT和FWA，它们的突变体在长日照(LD)条件下延迟开花，但在短日照(SD)条件下开花时间与野生型相似。CO是植物光周期信号传导途径中的关键基因，在光受体和生物钟的共同调控下， 基因表达量在一天之内呈节律性变化。Putterill等最早于1995年在拟南芥中找到一个比野生型开花延迟的突变体，然后采用图位克隆的方法分离到了 CO基因，该基因在根和叶中表达，在长日照下CO促使拟南芥开花，但是短日照条件下不起作用。后来，Yano等在水稻中克隆到拟南芥的CO同源基因HD1，HDl突变后水稻对光周期的敏感性降低。CO蛋白是一个转录因子，它不是决定植物开花的最终产物，而是通过调控下游基因FT和SOCl的表达控制开花时间。超表达CO基因后，FT和SOCl的表达量增加，开花时间提前，但是在FT突变体中超表达CO基因效果并不明显，说明CO是依赖于FT来调控植物开花时间。CO位于生物钟输出途径，在生物钟和开花时间之间起着纽带作用。墨兰(Cymbidium.sinense)是兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)中的小花型地生种，其花香馥郁，色泽淡雅，花姿秀美，叶态飘逸，备受欢迎，为我国传统铭花之一，具有很好的市场价值，是产业化最大的国兰。我国对花卉的传统消费期主要集中在春节和其它重要节假日，墨兰的花期自10月至翌年3月，墨兰的消费也主要集中在春节，在其它时间， 由于其不能开花，市场消费也比较有限。要扩大墨兰的产业化还要能够开花应节上市，其商品价值才会更高。影响墨兰生长发育与开花的因子有肥料、基质、温度、光照、激素等，目前生产上还没有墨兰花期调控的技术体系。目前，墨兰花期调控方面的研究比较少，潘瑞炽和叶庆生发现低温可促进墨兰的花芽分化和发育。光照也是影响墨兰花芽分化、花梗生长乃至开花的重要因素。在秋季， 如果光照不足，其花芽分化会推迟，且分化的花芽数量减少；光照的强弱对墨兰的花色也有明显的影响，若光线不足，则花色黯淡；光线较强时，则花色鲜艳，但光照过强也会使花色变淡，而且会使花期缩短(朱根发和郭振飞，2004)。因此，在墨兰的花期调节中应适时的给予适当的光照才能保证正常花芽分化和开花，甚至提早开花。但光照影响墨兰开花的分子机理尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种在墨兰中表达的、与光周期相关的CONSTANS-Iike基因-CsCOLl基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第40位到1020位碱基所示，及其编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示和含有CsCOLl基因的重组植物表达载体。本专利技术以墨兰“企剑白墨”(Cymbidium.sinense ‘Qi Jian Bai Mo，)的花芽为材料，提取其总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA第一链，以该cDNA第一链模板，根据 CONSTANS-Iike的同源基因保守区域设计引物，利用RT-PCR和RACE的方法扩增拼接获得全长cDNA序列，该cDNA序列长度为1186bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，其开放阅读框为自 5，端第40位至第1020位碱基，共981bp，将此开放阅读框命名为CsCOLl基因，其编码3 个氨基酸，其序列如SEQ ID NO. 2所示，将该蛋白命名为CsCOLl蛋白。将墨兰的CsCOLl编码的蛋白质序列用ClustalW2分析其同源性，结果如图1所示，图1显示CsCOLl蛋白具有两个保守的B-box-type锌指域和一个CCT域，它与蝴蝶兰的 PhalCOL同源性最高，为84 85%;与水稻Hdl、拟南芥AtCO的同源性分别为42%和38%。 由此可见，CsCOLl基因是一个新的光周期关键基因CONSTANS-like。本专利技术人将上述CsCOLl基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导，将含有 CsCOLl基因的重组植物表达载体转化到烟草中，经组织培养成含有CsCOLl基因的转基因烟草。实验发现，该转基因烟草与野生型烟草相比，转基因烟草比野生型烟草提前开花， 10个转化株的平均开花时间为49天，而野生型的平均开花时间为63天。由此表明，外源 CsCOLl基因为具有功能的结构基因，其在宿主烟草中实现了超量表达，促进了转基因烟草生殖生长，从而缩短了开花时间，因此该基因能影响植株的发育。从上述结果分析可以表明，本专利技术的CsCOLl基因是一个新的与光周期相关的 CONSTANS-like基因，该基因能促进植物生殖生长，缩短开花时间，从而影响植株的发育。因此本专利技术的第二个目的是提供CsCOLl基因在缩短植物童期，促进植物开花中的应用。所述的植物优选为烟草或墨兰。本专利技术的CsCOLl基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导进入植物细胞、组织或器官，通过组织培养成转基因的植物转化体，从而实现缩短植物童期生长期，促进植物开花。所述的植物表达载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如PBI系列载体、pBin系列载体、Gateway 系列载体、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体等，上述载体均为公开销售的商品。本专利技术首次从墨兰中克隆的CONSTANS-like基因-CsCOLl基因，并且通过实验证明该基因能够影响植物生长发育进程，促使植物提前开花。因此，本专利技术提供的墨兰CsCOLl 基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。附图说明图1是墨兰CsCOLl基因编码的氨基酸序列与CONSTANS-like同源基因的氨基酸序列比较图，其中拟南芥AtCO (Acc. No. NP_197088)，拟南芥AtCOLl (Acc. No. NP_197089. 1)，拟南芥 AtC0L2(Acc. No. NP_186887. 1)，拟南芥 AtC0L3 (Acc.No. NP_973530. 1)，水稻 Hdl (Acc. No. ABB17664)，大麦 HvCOL (Acc. No. AAM74069)，蝴蝶兰 PhalCOL ((Acc. No. FJ469986)，具有一致性和相似性的氨基酸分别用黑色和灰色阴影表示， CONSTANS-Iike基因的B_box域和CCT域在序列上用横线注明；图2是通过Real-time PCR检测CsCOLl基因在墨兰营养器官根、茎、叶中的表达量，其中横坐标中1为根；2为假鳞茎；3为叶；纵坐标代表相对表达量的高低；图3是通过Real-time PCR检测CsCOLl基因在墨兰花梗、花蕾及花器官花柄、萼片、花瓣、唇瓣、柱头、茎、叶中的表达量，其中横坐标中1为花梗；2为花柄本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张建霞，曾宋君，田瑞雪，段俊，吴坤林，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：