辅助鉴定杜鹃蓟马的方法及其专用引物对技术

本发明专利技术公开了一种辅助鉴定杜鹃蓟马的方法及其专用引物对。本发明专利技术提供的特异引物对，由序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成。所述特异引物对可用于辅助鉴定杜鹃蓟马。本发明专利技术具有如下优点：(1)实现了杜鹃蓟马快速鉴定，解决了其非成虫态样品的鉴定问题，开辟了两种形态相似蓟马(黄胸蓟马和杜鹃蓟马)鉴定的新途径；(2)操作简便，经济易行，传统形态鉴定方法一般需要玻片标本制作技能，对样品完整性等要求高，而特异引物分子鉴定方法可标准化，操作简便且所需费用较低，便于无专业分类学知识背景的工作人员操作与运用，在实际工作中容易推广应用；(3)检测灵敏度高，耗时短，且可以实现高通量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及昆虫检疫鉴定和害虫监测领域，具体涉及一种辅助鉴定杜鹃蓟马的方法及其专用引物对。
技术介绍
蓟马是有害生物类群，约有5500种，蓟马的检疫和控制具有重要经济意义。对经济具有重大影响的蓟马约550余种，多发生在热带和亚热带地区，对水果、蔬菜生产造成直接危害，给热带地区果蔬产品的进出口贸易和调运带来严重影响，在世界植物检疫中占有重要地位。蓟马体型细小，通常为1-1. 5_，繁殖力强、并喜爱栖息于隐秘场所，分布广泛，是农业生产和检疫上的重要害虫。对经济具有重大影响的蓟马，如西花蓟马(Frankliniella occidentalis)、黄胸蓟马(Thrips hawaiiensis)、杜胃$蓟马(Thrips andrewsi)、普通大蓟马(Megalurothrips usitatus)、烟蓟马(Thrips tabaci)、掠榈蓟马(Thrips palmi)、葱韭蓟马(Thrips alliorum、)茶黄硬蓟马(Scirtothrips dorsalis)、鳄梨蓟马(Scirtothrips perseae)等，从国外入侵以及在国内进一步扩散的风险极大，对农业生产和贸易构成了严重威胁。蓟马疫情的发展已引起国家高度重视，要求相关部门加强其检疫鉴定、疫情监测及控制工作。从进口果蔬产品、植物花卉中所截获到的蓟马以及在国内农业生产疫情监测中所诱捕到的蓟马，均需对其进行快速、准确的种类鉴定。传统的蓟马种类鉴定技术是以成虫形态特征为依据，难于对未成熟虫态(卵和幼虫)、残损样品以及形态上非常相近的种类(如黄胸蓟马和杜鹃蓟马)进行鉴定，无法满足农业生产诊断防控及植物检疫实际工作中所面对的特殊需求(快速、准确、大规模、高通量检测鉴定蓟马种类)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种辅助鉴定杜鹃蓟马的方法及其专用引物对。本专利技术提供了辅助鉴定杜鹃蓟马的特异引物对，由序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成。所述特异引物对可用于制备试剂盒；所述试剂盒具有如下(a)和/或(b)所述的功能(a)辅助鉴定杜鹃蓟马；(b)辅助鉴别杜鹃蓟马和黄胸蓟马。本专利技术还保护包括所述特异引物对的试剂盒，；所述试剂盒具有如下(a)和/或 (b)所述的功能(a)辅助鉴定杜鹃蓟马；(b)辅助鉴别杜鹃蓟马和黄胸蓟马。所述试剂盒还可具有其它PCR扩增的常规组分，如Taq酶、10XPCR Buffer (含Mg2+)、dNTPs等。本专利技术还提供了一种辅助鉴定杜鹃蓟马的方法，包括如下步骤以待测蓟马的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；如果得到250-500bp的PCR扩增产物， 所述待测蓟马为候选的杜鹃蓟马；如果没有得到250-500bp的PCR扩增产物，所述待测蓟马为候选的非杜鹃蓟马。所述PCR扩增产物具体可为285bp-295bp，如289bp。所述待测蓟马为杜醇蓟马、黄胸蓟马、Thrips parvispinus或普通大蓟马。本专利技术还保护一种辅助鉴别杜鹃蓟马和黄胸蓟马的方法，包括如下步骤以待测蓟马的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；如果得到250-500bp的PCR扩增产物，所述待测蓟马为候选的杜鹃蓟马；如果没有得到250-500bp的PCR扩增产物，所述待测蓟马为候选的黄胸蓟马。所述PCR扩增产物具体可为285bp-295bp，如289bp。所述待测蓟马为杜鹃蓟马或黄胸蓟马。所述特异引物对可用于辅助鉴定杜鹃蓟马。所述特异引物对可用于在辅助鉴别杜鹃蓟马和黄胸蓟马。所述特异引物对可用于辅助鉴定待测植物是否被杜鹃蓟马侵染。本专利技术具体解决的问题如下(1)解决杜鹃蓟马的快速鉴定问题，实现形态相似的两种蓟马(黄胸蓟马和杜鹃蓟马)的区分，实现果蔬和园艺植物上常见的蓟马中杜鹃蓟马的鉴定；(2)解决了杜鹃蓟马非成虫态样品的种类鉴定问题；(3)开发杜鹃蓟马特异鉴定试剂盒，实现杜鹃蓟马的高效、便捷、准确鉴定。本专利技术具有如下优点(1)实现了杜鹃蓟马快速鉴定，解决了其非成虫态样品的鉴定问题，开辟了两种形态相似蓟马(黄胸蓟马和杜鹃蓟马)鉴定的新途径；(2)操作简便，经济易行，传统形态鉴定方法一般需要玻片标本制作技能，对样品完整性等要求高，而特异引物分子鉴定方法可标准化，操作简便且所需费用较低，便于无专业分类学知识背景的工作人员操作与运用，在实际工作中容易推广应用；(3)检测灵敏度高，耗时短，且可以实现高通量检测。附图说明图I为特异引物对特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图。图2为特异引物对灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。杜鹃蓟马又称杜鹃花蓟马。实施例I、特异引物对的设计首先收集果蔬和园艺植物上常见的蓟马种类，其中包括形态相似的黄胸蓟马和杜鹃蓟马。通过基因组DNA提取和PCR扩增获取其线粒体细胞色素氧化酶亚基I条形码 (mtDNA COI barcode)序列，同时收集 BOLD 数据库和 GenBank 中蓟马属 Thrips Linnaeus 的其他种的mtDNA COI条形码基因序列。在此基础上，采用DNAMAN软件对不同种的mtDNA COI条形码进行比对分析，查找杜鹃蓟马的特异序列区段。采用人工设计杜鹃蓟马的特异引物对，并用Oligo软件和Blast程序对引物进行评估检查。在标准的PCR反应体系和反应条件下，对特异引物进行筛选，仅对该引物所对应的目标种——杜鹃蓟马为阳性反应(产生特异性条带)，对其余种类均为阴性反应(无特异性条带产生)的引物即为杜鹃蓟马的特异引物对。特异引物对的核苷酸序列如下(靶序列长度约为289bp ;因个体差异性靶序列长度处于285-295bp范围内)TAndr-F (序列表的序列 I) :5’ -CATAGCAITTCCACGACTT-3’ ；TAndr-R (序列表的序列 2) :5’ -AAAGTACAGATCAAACAAAAAG-3’。实施例2、实施例I设计的引物对的特异性杜醇蓟马(Thrips andrewsi)、黄胸蓟马(Thrips hawaiiensis)和普通大蓟马 (Megalurothrips usitatus):公众可以从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得，提及以上品种的文献为张桂玲.中国蓟马科分类研究.陕西西北农林科技大学，2003。Thrips parvispinus :公众可以从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得，提及该品种的文献为Mound, L. A. &Collins D. ff. , (2000)A south east Asian pest species newly recorded from Europe Thrips parvispinus(Thysanoptera Thripidae), its confused identity and potential quarantine significance. Journal of European Entomolo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：伍祎，刘奎，邱海燕，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：