具有反硝化性能的反硝化产碱菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株具有反硝化性能的反硝化产碱菌，及其在生物处理氮氧化物中的应用。保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC?NO：M2011368，保藏日期2011年10月28日。本发明专利技术提供了一种高效、耐受能力强的具有硝酸盐降解能力的反硝化产碱菌及其应用，该菌株在4d内能对初始浓度为260mg/L的硝酸根去除率达到93％，该降解菌的发现对工业废水中硝酸盐的高效净化具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株具有反硝化性能的反硝化产碱菌，及其在生物处理氮氧化物中的应用。
技术介绍
硝酸盐经各种途径输入水系，促使了富营养化的发展，水域污染越来越严重。这些营养盐类来自工农业废水的排放，也来自麦田冲入的化学肥料以及畜牧粪便等方面。硝酸盐在正常的健康人体中能很快地被肠道吸收，食物和人肠胃中的微生物可使硝酸盐转化为亚硝酸盐，可导致婴幼儿变性血红蛋白血症,此外,硝酸盐在人体中会转化成为亚硝胺,这是一种致突变、致畸、致癌物，对人体具有严重的潜在威胁，所以现在各国对饮水中硝态氮含量有比较严格的规定。因此研究硝态氮的净化技术就显得十分迫切和重要。传统理论认为只有在缺氧条件下反硝化酶系才具有活性，但后来一些学者研究发现有些细菌可以在有O2的条件下进行反硝化作用，如Alcaligenes faecalis、Thiosphaera pantotropha、Pseudomonas nautical、Microvirgula aerodenitr if icans 等。国内关于好氧化硝化菌的筛选与研究还处于起步阶段，对解决亚硝酸态氮积累的研究更为少见，经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用本专利技术中的反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrif icans) TB降解硝酸盐的报道。该降解菌的发现对工业废水中硝酸盐等污染物的高效净化具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效、耐受能力强的具有硝酸盐降解能力的反硝化产碱菌及其用途。本专利技术采用的技术方案是一株具有反硝化性能的反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrif icans) TB,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮政编码430072，保藏编号 CCTCC NO M 2011368，保藏日期 2011 年 10 月 28 日。该菌株的特征为菌落颜色为白色，菌落呈小型单个菌落，凸起，不透明，表面光滑，边缘整齐。透射电镜下观察该菌体的形态为长杆菌，具有鞭毛，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性。它生长最适pH值为9，最适温度为30°C。该菌株16S rDNA序列如SEQ ID No. I 所示。本专利技术还涉及所述的反硝化产碱菌TB在生物处理氮氧化物中的应用。氮氧化物指的是只由氮、氧两种元素组成的化合物。常见的氮氧化物有一氧化氮(NO，无色)、二氧化氮(NO2，红棕色)、笑气(N20)、五氧化二氮(N2O5)等，其中除五氧化二氮常态下呈固体外，其他氮氧化物常态下都呈气态。作为空气污染物的氮氧化物(NOx)常指NO和NO2，本专利技术中亦是指NO和NO2。具体的，所述菌株用于处理含有氮氧化物的废水或废气，废水中氮氧化物以酸根形式如NO3-离子形式存在。优选的，所述菌株用于处理含有no3_的废水。具体的，所述应用为将所述反硝化产碱菌TB经培养获得的菌悬液投入到含NO3-的废水中，在20 40°C、pH 4 9，好氧条件下培养。反硝化产碱菌TB接种量以0D600为0. 4的菌液计优选为I 2% (v/v)。本专利技术的有益效果主要体现在本专利技术提供了一种高效、耐受能力强的具有硝酸盐降解能力的反硝化产碱菌及其应用，该菌株在4d内能对初始浓度为260mg/L的硝酸根去除率达到93%，该降解菌的发现对工业废水中硝酸盐的高效净化具有重要意义。附图说明图I为Alcaligenes denitrif icans TB的透射电镜照片和革兰氏染色照片；图2 为 Alcaligenes denitrif icans TB 的系统发育树图3不同pH下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能比较；图4不同接种量下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能比较；图5不同碳源下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能比较；图6不同C/N下菌Alcaligenes denitrif icans TB的反硝化性能比较；具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此实施例I :Alcaligenes denitrif icans TB的分离、纯化及其鉴定I. Alcaligenes denitrif icans TB 的分离及纯化Alcaligenes denitrif icans TB是从浙江省杭州市七格污水处理厂的活性污泥中筛得的反硝化菌诱变得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下取浙江省杭州市七格污水处理厂的活性污泥中筛得的反硝化菌。将筛得的菌种制成菌悬液，取3mL菌悬液移入直径为9cm的无菌培养皿中，放一无菌磁力转子,置于磁力搅拌器上，30W紫外灯下30cm处照射lmin。在红外灯下取照射过的菌液0. ImL涂布于平板培养基上，用黑布包好平板，30°C恒温培养3d。配制筛选培养基，配制方法如下琥珀酸钠IOOOOmg L_S KH2PO4IOOOmg L—1， K2HPO4IOOOmg L-1，MgSO4. 7H20 200mg I71，CuSO4Img I71，FeSO4Img L' MnS045mg I71， Na2MoO4Img I71，ZnCl22mg I71，NaNO3IOOOmg L'溶剂为水，pH 7. 2，121°C灭菌 20min。待培养基冷却后，将突变菌株接种于培养基上，培养2d，挑取有蓝色晕圈的菌株。将筛选出的菌株接种于以硝酸钠或亚硝酸钠为唯一氮源的培养基中，30°C，120r miiT1振荡培养。配制LB固体培养基,配制方法如下NaCl IOOOOmg I71,酵母膏5000mg I71,蛋白胨 IOOOOmg I71，pH 7. 2，琼脂 20000mg I71，溶剂为水；121°C灭菌 20min。结合 LB 平板划线分离，挑取单菌落接入LB固体培养基摇床培养，直到获得在上述培养基中生长快、菌落规则和性状稳定的反硝化单菌TB (即CCTCC NO M 2011368)。2. Alcaligenes denitrif icans TB 的鉴定通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定TB菌为Alcaligenes denitrificanso具体步骤如下采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2. 2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和纯化菌的DNA，4°C保存。选用细菌的通用引物BSF8/20和BSR1541/20对纯化的 DNA进行PCR扩增，弓I物序列分别为BSF8/20 :5' -AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'BSR1541/20 :5' -AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'PCR反应程序设定为先94°C预变性4min ;然后94°C变性lmin，59°C退火lmin， 72°C延伸I. 5min，循环35个周期；然后72°C延伸IOmin ;最后4°C保持lOmin。将PCR产物进行测序(上海英潍捷基)，测序结果见序列表。将PBT的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号JQ044686，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较,发现其属于A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈浚，朱滨欢，蒋轶锋，陈建孟，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：