渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉的筛选及应用制造技术

本发明专利技术提供一种分离自渤海湾水域的枝顶孢霉菌株BH-0531及其筛选和应用。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC-5445。该菌种由采自渤海湾底层海水的样本中分离，经筛选、鉴定获得。本发明专利技术分离筛选的BH-0531菌株属于枝顶孢霉属（旧称头孢霉属）具有海洋微生物的生长温度低和高盐条件下生长的特性，具有产生杀线虫活性代谢产物的能力，所产生的杀线虫物质具有很好的热稳定性和水溶性，实验条件下杀线虫活性可达94%以上，可用于杀线虫剂和抗生素等生物活性物质的发酵生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋生物资源及微生物菌种，具体体现在一种分离自渤海湾水域的杀线虫枝顶孢霉菌株UcreMWi^B cephalosporium) BH-0531及其筛选和应用。
技术介绍
线虫作为一类重要的病原物，它的危害已成为农林生产上的重要问题。全世界已报道的植物寄生线虫达200多属5000余种。植物寄生线虫病害给全世界农业每年带来近1250亿美元的经济损失，仅次于真菌病害。因此，治理土壤及植物寄生线虫已成为一个全球性的、迫切学要解决的重要问题。化学杀线剂，如40年代早期出现的溴甲烷，50年代后期出现氨基甲酸酯类和有机磷酸酯类等，多为有毒农药，被发现有致畸、致癌等剧毒作用，同时存在严重的3R问题抗药性、药物残留、害虫再猖撅。随着人类环保意识的增强，生物防治已成为线虫防治的主导。微生物是一类种类繁多的可再生资源，是最丰富的遗传基因库，也是植物病原线虫的重要天敌，以及次级代谢产物是生物活性物质的重要来源。目前开发的第一代线虫生防制剂主要是活菌体制剂，其中研究最多的生防因子包括捕食线虫真菌、内寄生真菌和寄生性细菌。但活菌体制剂由于土壤生态系统中的微生物区系之间存在着不同程度的相互抑制作用，导致活体生防菌在不同国家的不同类型土壤中防治效果的不稳定性和不一致性，使得其使用受到很大限制。真菌的次生代谢产物作为第二代线虫生防因子，以直接作用于农作物线虫的方式发挥作用，有着作用快、药效高、环境相容性好、不容易造成二次污染等优点。已发现的杀线虫活性代谢物进行统计有179种之多，包括生物碱类，多肽类，萜类，大环内酯类，氧杂环类，苯并类，醌类，脂肪类，简单芳香类等。但多停留于实验室研究阶段，且大多为水溶性较差的脂溶性物质，需要通过添加增效剂来助溶，这为实际应用造成了困难。因此，开发出高效、低毒、相对专一性以及廉价的微生物杀线剂，将会是今后的研究重点。海洋占地球总面积71%，地球生物80%生活在海洋。海洋特殊的环境空间造就了海洋生物独特的次级代谢循环，演化出了不同于陆生生物的遗传背景和代谢途径，是寻找新药或先导化合物的宝贵资源。c印halosporin C是最早从海洋真菌中分离到的抗生素，此后有关这方面的研究成指数增长，如澳大利亚Capon研究组从南澳大利亚海洋筛选出两株杀线虫海洋真菌Asper^iVAz1S caneus 和 Raspailia sp (Caponn RJ，2003)。肖永堂等(2005)对188株海洋真菌代谢物进行杀线虫毒力测定，毒力级别达到A级的菌株占1. 60% ；而死亡率达50%以上的菌株占总数的43. 1%。郑忠辉等(2005)对一株海洋真菌代谢物对小杆线虫作用现象进行观察，认为是一种神经毒剂。展示了海洋真菌在杀线虫领域的潜能。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于克服现有杀线虫剂中存在的不足和杀线虫剂高效生产菌种资源匮乏的问题，从而提供一株具有杀线虫功用的渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531菌株(保藏号CGMCC-5445)。本专利技术的另一个目的在于提供一种渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株的筛选方法。本专利技术的还一个目的在于提供一种渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531菌株在制备作为生物活性物质用于农用杀虫剂、生物农药和抗生素发酵生产中的应用。为实现上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案一种渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株(.Acremonium cephalosporium )BH-0531菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC-5445。保藏时间2011-11_4。该菌种是由采自渤海的(经度E 117° 53' 23.2"，纬度N 38° 55' 51.0〃)底层海水样本中分离。菌落特征在查氏琼脂上7d直径33-35mm，14d达50-65 mm ；初始质地绒毡状；初生菌丝体白色，随培养时间延长呈浅黄至浅粉红色，由于大量孢子产生菌落质地成粉质状，菌落边缘近整齐；无渗出液；菌落反面呈浅橘或黄色。菌丝特征有隔，较细，直径(2.0士 μ m)；分生孢子梗从菌丝生出，直立，短小，末端渐细，顶端球形，生分生孢子无隔、多为椭圆形，长轴直径3. 0 4. 0 μ m，短轴直径2. 1士 μ m，壁近于光滑。枝顶孢霉BH-0531菌株隶属于枝顶孢霉属Ucremonium ；旧称头孢霉属，Cephalosporium.)。该菌株具有在海水培养基和不含海水的查氏、PDA等培养基上生长，并产生杀线虫等活性物质的性能，所产生的活性物质杀线虫活性高，还可抑制真菌和细菌的生长。因此可应用于杀线虫生防制剂、生物农药和抗生素等发酵生产领域。本专利技术所述的筛选指的是以线虫的死亡率为指标对菌株的杀线虫能力进行评价。本专利技术进一步公开了渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531的筛选方法，其特征在于(1)菌种的分离、纯化样本来自渤海湾的底层海水，经孔径0.45 μ m硝酸纤维素滤膜(f50)过滤后，将滤膜置于海水固体培养基上，于沈！恒温培养获得菌落，采用挑单孢法，将其转入新的平板培养，此过程反复进行，直至菌落纯化为止；所述的海水固体培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏 2g/L，海水 600mL/L，蒸馏水 400mL/L，琼脂 20 g/L ；(2)菌种的筛选1)将上述分离纯化的菌种接种于液体培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵培养后的培养液经孔径为0. 22Mffl滤膜过滤，收集得到发酵滤液；其中所述的液体培养基是指查氏液体培养基=NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, KCl 0. 5 g/L, MgSO4 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L，蔗糖 30g/L, PH 自然；或海水液体培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸馏水400mL/L ；培养条件为接种量2 X IO6的孢子悬液，转速120r/min，初始pH6. 5J6°C发酵96h ；2)使用M孔细胞培养板，在每孔中加入ImL发酵滤液和100μ L线虫悬液(平均1500头线虫/100 μ L)，^TC静置3d，5d后，解剖镜下统计线虫死亡率；分离筛选后获得具有杀线虫功用的来自渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531，其毒力级别达到死亡率彡90%的A级；(3)菌种培养条件的优化优化的培养基为去皮马铃薯150g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，海水含量600ml/L ； 其中去皮马铃薯150g/L指的是去皮马铃薯150g置400mL蒸馏水中煮汁，取汁液，再定容至 400mL ；优化的培养条件为接种量2X IO6的孢子悬液，转速120r/min，初始pH6. 5J6°C发酵 96h ；培养得到杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株。本专利技术所述及的筛选是指利用线虫死亡率作为指标，通过对菌株的杀线虫能力进行评价，以线虫死亡率高(死亡率> 90%)为标准实施筛选，所述线虫为松材线虫(由中国农科学院植保所提供)。本专利技术从渤海水域分离得到并证实具有杀线活性的BH-0531菌株就是在这种背景下利用线虫死亡率作为指标，通过实验对发酵影响较大的PH值、接种量、培养温度、 培养时间等培养条件和碳氮源及其含量进行优化而获得的。其杀线本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆恒，史晓讯，孟凡欢，冯欣，孙建华，孙金生，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：