表达载体及应用微藻产生油脂的方法技术

一种表达载体，包括蛋白质表达盒以及至少两个同源重组DNA片段，分别位于该蛋白质表达盒两侧；其中该蛋白质表达盒包括：第一筛选标记；启动子；多重克隆位点，邻接于该启动子下游；以及第二筛选标记，其中该启动子包括花椰菜叶病毒(CaMV)35S启动子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose?bisphosphate?carboxylase)(RBCs)启动子、腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子、硝酸盐还原酶(NR)启动子或上述组合。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可在微藻中表达外源基因的表达载体，特别是涉及利用此表达载体提高微藻产油效率的方法。
技术介绍
微藻(microalgae)是一群微型生物的总称，包括众多真核和原核种类。微藻可以直接利用太阳能生产高品质的蛋白质和其它营养物质以及特殊生物活性物质。实际上微藻广泛应用在食品、饲料、医药等领域，生产例如藻体粉、长链不饱和脂肪酸、色素蛋白、或藻多糖等。近年来，随着原油价格飞涨及使用化石燃料引发的全球暖化问题，利用微藻制造生物燃料的构想也持续受到全球关注。美国专利申请公开号US2010/0167339A1记载提高微藻浓度的条件及步骤，利用固体颗粒激烈搅动微藻，使其破裂，形成微藻浆，以吸收性泡沫分离步骤处理微藻浆，而形成流动性佳的藻体生物质，可应用于生物燃料中。鉴于微藻的应用前景及高价值化，利用遗传工程改良微藻细胞中的基因产物，已被广泛使用。例如美国专利申请US2009/0176272A1记载一种生产生物燃料用的核酸序列的表达，使编码与形成丙酮酸脱氢酶复合体的脂肪酸生物合成相关的蛋白的基因通过重组质粒pDs69i 在藻体中表达，提高脂肪酸的产量。W02009/073822A2揭示一种提高微藻生产生物燃料的基因及化学工程策略，通过包含一表达盒、一基因堆栈表达载体及一表达载体的重组藻体所达成，其中该表达盒包括抑制编码Cao、LHCII-b、DC、PFL1/PFLA或AGP酶的蛋白质的代谢基因表达的siRNA分子； 该基因堆栈的表达载体包括编码ACCase、DGAT, caleosin及oleosin多肽的核酸序列；以及该表达载体包括编码PCC 7942ftp-l基因的核酸序列。本专利技术人等鉴于先前技术的繁复操作步骤及产生油脂的效率，根据微藻的生理特性，设计新颖的表达载体，通过基因工程重组产油相关基因，突破野生型微藻无法兼具高光合效率、高二氧化碳固定效率及生长速率的特性，在传统的微藻培养系统中，提高产油效率。
技术实现思路
本专利技术的一个实施方案中，提供一种表达载体，包括一蛋白质表达盒以及至少两个同源重组DNA片段，分别位于该蛋白质表达盒的两侧；其中该蛋白质表达盒包括第一筛选标记；启动子；多重克隆位点，邻接于该启动子的下游；以及第二筛选标记，其中该启动子包括花椰菜叶病毒(Cauliflower mosaic virus ;CaMV) 35S启动子、1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose bisphosphate carboxylase ；RBCs)启动子、腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase ；AMT)启云力子、硝酸盐还原酶(nitrate reductase ； NR)启动子或上述组合。本专利技术的另一个实施方案中，提供一种在微藻中表达蛋白质的方法，包括将一外源基因克隆入上述表达载体中；将该具有外源基因的表达载体转化至微藻中，以及表达该外源基因。本专利技术的另一个实施方案中，提供一种应用微藻产生油脂的方法，包括提供一种如上述的表达载体；将至少一外源基因插入该多重克隆位点；将该具有至少一外源基因的表达载体转化至微藻中；以及于微藻中表达该至少一外源基因；其中，该外源基因包括编码与脂质生物合成相关的酶的基因或与前述基因的序列同一性至少为80%的基因。在本专利技术的一种具体实施方案中，该外源基因选自下组编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因(SEQ ID NO :1 6)、甘油_3_磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因(SEQ IDNO 7 10)、编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因(SEQ IDNO :11 12)、编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO 13 16)、编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO 17 21)、编码乙酰基-CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ ID NO :22)、编码碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ IDNO :23)、以及与前述任一基因的序列同一性至少为80%的核苷酸序列。本文所述的”表达载体”意指可将特定基因导入宿主细胞中使该基因表达的核酸分子，通常为质粒，例如Ti质粒(tumor inducing plasmid)、pBI121 二元载体(binary vector)、pBluescript II SK+噬菌粒(phagemid)、或类似的载体或质粒。为了基因的表达， 表达载体通常还包括调控序列(regulatory sequence)，例如增强子(enhancer)、启动子 (promoter)等；以及报道基因(importer gene)，例如编码荧光蛋白质的核苷酸序列。为了进行克隆(cloning)，表达载体通常还包括筛选基因，例如抗生素基因；以及多重克隆位点 (multiple cloning site ；MCS)。本文所述的”蛋白质表达盒”(protein expression cassette)意指由一个以上的基因及控制该基因表达的序列所组成的表达蛋白质的盒。表达盒通常为表达载体的一部分，用于克隆及转化。一般来说，表达盒可包括启动子序列、开放阅读框(open reading frame)、该基因表达所需的核苷酸序列、或转化于宿主细胞所需的核苷酸序列。本文所述的”同源重组 DNA 片段”(homologous recombinant DNAfragment)意指可与同源DNA序列配对进行交换的序列片段，分别位于该蛋白质表达盒的两侧，该”两侧” 代表位于两翼位置(flanking)，即，紧邻该蛋白质表达盒的上游(5’侧翼位置)及下游(3’ 侧翼位置)。例如可与植物细胞的遗传物质同源交换的序列，可包括T-DNA序列中的左端 (left border ；LB)及右端(right border ；RB)，例如 SEQ ID NO 24 或 25 所示的序列、其部分序列、或的上述组合，但没有特别限定。同源重组DNA片段可根据表达载体或宿主细胞的特性等条件以公知的DNA重组技术适当设计、合成。本文所述的”筛选标记”包括用于特定基因的克隆及报导，例如编码卡那霉素 (Kanamycin)抗生素的基因、编码的遗传霉素(Geneticin ；G418)抗生素的基因、编码博莱霉素抗生素(Zeocin)的基因、编码潮霉素抗生素(Hygromycin)的基因、编码红色荧光蛋白 (DsRed)的基因、编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因、编码蓝色荧光蛋白(BFP)的基因、或类似的基因。筛选标记基因可根据表达载体的特性及克隆的基因性质适当设计，没有特定的限制。本文所述的”启动子”意指在基因表达时容许RNA聚合酶连接的核苷酸序列，为转录作用(transcription)的开始。本文的启动子的设计，考量欲表达的核苷酸序列及表达载体的性质，可采用单启动子、双启动子或多启动子的模式，以提高欲表达基因的表达量。本文所述的”多重克隆位点”意指具有一个以上的限制性酶切位点的序列片段，邻接于启动子的下游，该”邻接”表示其间隔距离仅为数个至数十个核苷酸以内，且仍然操作性连接(operatably linked)于启动子，可受启动子的调控。常用的限制性酶切位点，例如 SacI> Ecol、XbaI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2010.12.10 CN 201010585274.31.表达载体，包括 蛋白质表达盒；和至少两个同源重组DNA片段，分别位于该蛋白质表达盒两侧；其中该蛋白质表达盒包括第一筛选标记；启动子；多重克隆位点，邻接于该启动子下游；以及第二筛选标记，其中该启动子包括花椰菜叶病毒(CaMV) 35S启动子、1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(RBCs)启动子、腺嘌呤甲基转移酶(AMT)启动子、硝酸盐还原酶(NR)启动子或上述组合 ο2.如权利要求1所述的表达载体，其中，该至少两个同源重组DNA片段包括LB片段 (SEQ ID N0:24)、RB片段(SEQ ID NO :25)、其部份序列、或上述组合。3.如权利要求1所述的表达载体，其中，该第一筛选标记包括编码红色荧光蛋白 (DsRed)的基因、编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因、或编码蓝色荧光蛋白(BFP)的基因，该第二筛选标记包括编码遗传霉素(G418)的基因、编码博莱霉素(Zeocin)的基因、或编码潮霉素(Hygromycin)的基因。4.如权利要求1所述的表达载体，其中，该多重克隆位点包括限制性酶切位点SacI、 EcoI、XbaI、SpeI、SmaI、EcoRI、HindIII、AccI、SalI Jci I、ApaI、KpnI、Acc65I、MRrh4273I、 MthsI、MXcyI、Mcfr9I、MRsrI、McoRI、MSsoI、MSau3239I、MPaeR7I、MBstVI、PspOMI 或上述组合。5.如权利要求1所述的表达载体，其中，该蛋白质表达盒还包括至少一个外源基因，其插入该多重克隆位点。6.如权利要求5所述的表达载体，其中，该外源基因包括选自下组的基因 编码甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的基因(SEQ ID NO :1 6)、编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)的基因(SEQ ID NO 7 10)、 编码溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因(SEQ ID NO 11 12)、 编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ ID NO 13 16)、 编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)的基因(SEQ ID NO 17 21)、 编码乙酰基-CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ ID NO :22)、 编码碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ ID N0:23)、以及与前述任一基因的序列同一性至少为80%的核苷酸序列。7.如权利要求1所述的表达载体，其中，该表达载体在微藻中表达。8.如权利要求7所述的表达载体，其中，该微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、拟球藻、 雨生血红藻或栅藻。9.一种在微藻中表达蛋白质的方法，包括将一外源基因克隆入如权利要求1-6中任一项的表达载体中； 将该具有外源基因的表达载体转化至微藻中，以及表达该外源基因。10.如权利要求9所述的在微藻中表达蛋白质的方法，其中该转化步骤是使用电穿孔法。11.如权利要求9或10所述的在微藻中表达蛋白质的方法，其中，该微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、拟球藻、雨生血红藻或栅藻。12.—种应用微藻产生油脂的方法，包括提供一种如权利要求1所述的表达载体；将至少一外源基因插入该多重克隆位点；将该具有至少一外源基因的表达载体转化至微藻中；以及...

【专利技术属性】
技术研发人员：简良荣，谢欣如，
申请(专利权)人：财团法人工业技术研究院，明志科技大学，
类型：发明
国别省市：