一种鳕鱼免疫活性肽制备的在线监控方法技术

本发明专利技术涉及一种鳕鱼免疫活性肽，及其制备的在线监控方法。所述的鳕鱼免疫活性肽，其制备方法是将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，水解度为16～17％时终止水解而制备的。并建立了GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs网络模型，从而对鳕鱼免疫活性肽的制备了在线监控方法。本发明专利技术确定了鳕鱼蛋白的最佳水解度，从而为获得最佳免疫效果的鳕鱼免疫活性肽奠定了基础。在确定了最佳水解度后，本发明专利技术建立了在线监控方法，可以通过生物传感器-人工神经网络模型可以在线监测水解反应程度。即使当水解条件波动时，如温度、pH、搅拌速率等变化时，其仍可以准确监测水解反应的程度。因此，本发明专利技术的方法具有很好的推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术酶工程
，具体涉及，可在生物活性肽的制备过程中动态监测水解过程，实现水解的可视化，从而最大程度的获取目标活性肽。
技术介绍
近年来已发现一些天然免疫活性肽如胸腺肽，可诱导淋巴细胞分化、增殖与成熟， 提高免疫低下小鼠的免疫活性。然而天然免疫活性肽在生物体中含量较少，制备成本高，价格昂贵。虽然化学方法可以大量合成免疫活性肽，但化学合成的免疫活性肽存在副反应和副产物较多的问题，其应用和发展受到限制。而酶法水解具有成本低、安全性好，并且易于大量制备等优点，因此目前生物活性肽的制备研究主要集中在酶法水解上面。但是蛋白酶解的程度对于活性肽的免疫效果具有重要的影响，其可以用水解度来表示。随着对生物活性肽生理功能认识的不断深入，发现水解度对酶解产物的生物学活性、 活性组分得率、肽段组成和分子量分布均有影响。适当控制酶解条件和水解度可以提高生物活性肽的生成量。例如，对乳铁蛋白水解产物的抑菌活性与水解度进行相关分析发现，在一定水解度范围内(DH小于10% )，随着乳铁蛋白水解度的提高，酶解产物的抑菌活性增强，但是水解度过大时酶解产物的抑菌活性却发生下降。因此，确定水解度就对于蛋白酶解产物的免疫调节活性具有重要作用，而实现蛋白酶的可控水解也就具有重要的意义。目前国内外的可控酶解的理论与方法主要集中在数学动力学模型模拟和酶解进程控制上，这为生物活性肽的制备及工业化应用提供了有益的参考。但目前对蛋白酶促水解反应的动力学研究发展较缓慢，其原因是虽然在方程中引入了产物抑制常数和底物常数，但大多仍停留在用米氏方程描述反应过程阶段。同时，由于酶解过程是一个相当复杂的过程，易受到各种外界条件影响，如温度波动、PH变化、酶活变化、搅拌速率不同、底物多样化等等，使得数学动力学方程十分繁琐复杂、难于真实地描述反应的全过程。因此动力学模型是有局限性的，完全依靠动力学模型难以实现酶解的可控操作，新的可控酶解理论与技术成为生物活性肽制备中亟待解决的重要课题。而生物传感器可以在线直接或间接监测酶解过程中产生的活性肽含量和分子量分布，可以有效实现活性肽的可控制备，显示出巨大优势。生物传感器技术把生物活性物质的检测，巧妙地与传感器技术、计算机辅助控制方法相结合，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测等特点。其原理是在传感器的化学电极的敏感面上组装固定化酶膜，当酶膜接触待测物质时，该膜对待测物质作出响应，催化它的固有反应，转化为电极中的电流或电位的变化，由计算机扑捉电信号，转化为测定该物质的数量数据。这样生物传感器就能够快速、可靠地获得酶解过程中某种或几种特定的氨基酸含量来间接反映产物水解度和多肽分布的信息，实现酶解的在线动态监测，为生物免疫活性肽制备的全自动控制提供了可能。所以，基于生物传感器建立的人工神经网络 (Artificial Neural Networks,ANNs)可用来实现生物活性肽制备的可视化。其具有自学习、自组织和自适应功能，可以充分逼近任意复杂的非线性关系，大规模并行处理，使快速进行大量运算成为可能，有很强的鲁棒性和容错性。正是由于BP-ANNs独特优势，构建鳕鱼免疫活性肽制备的动态监控模型具有可行性。因此，在线动态监控模型的建立将为鳕鱼蛋白免疫活性肽制备乃至其他特定功能生物活性肽的开发奠定了理论基础和技术支持。但根据文献调研和国内外查新结果可知，生物传感器在生物活性肽的酶法制备研究中尚未有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，从而解决目前没有能够及时准确地在线监控鳕鱼免疫活性肽酶解制备的问题，为免疫活性肽制备乃至其他特定功能生物活性肽的开发提供技术支持，为鳕鱼免疫活性肽实现在线控制制备提供了可操作依据。可应用于生产鳕鱼免疫活性肽及其他生物活性肽的在线监控制备。本专利技术的一个方面确定鳕鱼免疫活性肽，其制备方法是将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，水解度为16 17%时终止水解而制备的。本专利技术的另一个方面涉及，包括如下的步骤1)建立并训练人工神经网络，包括网络训练样本的制备、参数确定以及网络的训练步骤；A、网络训练样本的制备训练样本是指利用胰蛋白酶水解鳕鱼蛋白，通过改变初始底物浓度与初始蛋白酶浓度进行水解反应，分别对每一酶解反应的水解度和游离谷氨酸和游离赖氨酸进行测定；B、人工神经网络参数确定包括有网络模型的隐层数、传递函数、训练函数、学习函数、输入层节点、输出层节点、隐层节点数；。C、人工神经网络的训练与建立以训练样本为基础，根据选定的输入层节点的不同，建立并训练了 GLU-BP-ANNs、LYS-BP-ANNs网络模型；2)确定酶解系统中初始的底物浓度、初始加酶浓度；3)利用生物传感器监测水解反应中的特定的氨基酸每隔一定时间，将固定体积的酶解液注射到生物传感器内，利用特定氨基酸的氧化酶电极进行检测；4)将初始底物浓度、初始加酶浓度、特定氨基酸浓度等参数输入到训练好的人工神经网络，得出水解产物的水解度，从而实现免疫活性肽的在线监测。本专利技术确定了鳕鱼蛋白的最佳水解度，从而为获得最佳免疫效果的鳕鱼免疫活性肽奠定了基础。在确定了最佳水解度后，本专利技术建立了在线监控方法，可以通过生物传感器-人工神经网络模型可以在线监测水解反应程度。即使当水解条件波动时，如温度、pH、 搅拌速率等变化时，其仍可以准确监测水解反应的程度。因此，本专利技术的方法具有很好的推广应用前景。附图说明图1 本专利技术的在线监控方法的流程图。具体实施例方式本专利技术的一个方面是确定鳕鱼免疫活性肽的制备条件，将鳕鱼蛋白用胰蛋白酶水解，当水解度在0 16%时，随着水解度的增加，水解产物的免疫活性呈增加趋势；当水解度为16 17%时，水解产物呈现最高的免疫活性；当水解度大于17%时，随着水解度的增加，水解产物的免疫活性呈减小趋势。因此鳕鱼免疫活性肽可以控制水解度为16 17%进行水解制备。鳕鱼免疫活性肽制备条件的确定是通过体外淋巴细胞增殖实验对水解产物进行活性筛选，通过动物实验进行体内免疫活性验证，确定制备鳕鱼免疫活性肽所用的蛋白酶为胰蛋白酶，蛋白浓度25g/L、pH值8. 0、温度(50士 1) °C、时间290min和加酶量24U/mg, DH为16. 87%，其水解产物体外脾淋巴细胞平均增殖率为28. 45%。该条件下的水解产物能显著提高正常小鼠的淋巴细胞转化活性(P < 0. 05)、迟发型变态反应(ρ < 0. 05)和单核巨噬细胞的吞噬能力(P <0.05)。对于免疫功能低下小鼠，该水解产物能显著提高小鼠的免疫器官指数(P < 0. 05)；显著促进小鼠的迟发型变态反应(ρ < 0. 05)，提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P < 0. 05)，提高小鼠的细胞免疫功能；提高血清溶血素含量(P < 0. 05)，促进小鼠的体液免疫功能；显著促进小鼠的碳廓清能力(P < 0. 01)和腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数(P < 0. 05，P < 0. 01)，促进小鼠的非特异性免疫功能。因此该条件下得到的水解产物对增强体内免疫活性效果显著。如图1所示，本专利技术的另一个方面涉及，包括如下的步骤第一步建立并训练人工神经网络。包括网络训练样本的制备、参数确定以及网络本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯虎，李八方，赵雪，张朝辉，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：