本发明专利技术属于生物技术领域，公开了华支睾吸虫病TRFIA诊断试剂盒及其使用。本发明专利技术的华支睾吸虫病诊断试剂盒，包括：TRFIA反应板、阴性对照、阳性对照、铕标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液和增强液，所述TRFIA反应板上包被有华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2，所述华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2是具有SEQIDNO.1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。还进一步公开了该华支睾吸虫病诊断试剂盒中的应用。本发明专利技术的华支睾吸虫病诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、准确度高等特点，可较好地运用于华支睾吸虫病的诊断,本试剂盒的主要试剂均采用工作液形式，可直接使用，较传统的病原学诊断方法优势为：操作准确、简便、结果可信。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用时间分辨荧光分析法检测华支睾吸虫病的TRFIA试剂盒及其使用。
技术介绍
华支睾吸虫病是一种人兽共患寄生虫病，成虫寄生在肝胆管内，成虫会破坏胆道上皮和粘膜下血管，并产生分泌排泄抗原，引起胆管和胆管周围的炎症反应，导致胆管局限性扩张和胆管上皮细胞增生。一些抗原成分还能够通过胆管上皮细胞进入肝组织，引起炎症反应和肝功能损伤。长期的严重感染会导致纤维组织增生和肝细胞的萎缩变性，甚至引起癌变、腹水和肝硬化。肝吸虫阻塞胆管，使胆汁流出不畅，易合并细菌感染和出现胆石症。肝吸虫病的防治主要依靠综合防治措施。在流行区强化对人群的普查普治，并加强疫苗的研制，以减少传染源和保护易感人群。目前，肝吸虫病防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机理研究。转移酶类是催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类，是生物体内肝细胞结合反应(属第二相反应)中重要的催化剂之一。谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST) (EC2. 5. 1. 18)是广泛存在于各种生物体内的由多个基因编码的、多功能的同工酶，是催化谷胱甘肽与多种亲电子化合物连接的酶家族，构成酶的亚单位至少有7 个，大部分酶存在于细胞质中以同二聚体或异二聚体形式存在。GSTs在生物体中的重要功能之一是对内、外源性毒物的解毒作用。包括人在内的生物体都暴露在大量外源化合物存在的环境中，一些化合物在代谢活化后有亲电子反应性，导致与内源性分子共价结合，蛋白质是重要的生物大分子，外源分子与其结合后经常改变其功能。谷胱甘肽转移酶主要通过酶催化作用促使谷胱甘肽与有害异物结合，或以非酶结合方式将体内各种具有潜在毒性的化学物质、染料、致癌物从体内排出，从而达到解毒目的，近年来发现谷胱甘肽转移酶对于研究肝脏疾病的发生、发展、转归和预防有重要意义。 其催化反应特性决定了其在防止脂质过氧化损伤扩大、抵御及修复DNA损伤以降低肿瘤发生以及癌细胞耐药性形成等方面的重要作用。GSTs是抗恶性疟原虫潜在的药物靶标，蠕虫的GSTs参与对由虫体代谢和宿主免疫系统所产生的脂质过氧化物和细胞毒性的羰基的解毒，也被认为是免疫疗法和化学疗法的一个潜在的靶标。其中，主要定位于成虫实质的血吸虫GST16和GST-28，是WHO提出的 6个最具潜力的候选疫苗分子之一。在大肠杆菌中表达恶性疟原虫的重组GST有催化活性。 华支睾吸虫的^KDa GSI^P ^kDa GST的编码基因在原核表达也有催化活性，并且重组的 26kDaGST可用于检测IgG和IgE抗体。因而，原核表达有活性的重组GST是可行的.并且易于得到大量的重组蛋白质以用于功能研究。本专利技术人经过广泛而深入的研究，从华支睾吸虫中分离了编码谷胱甘肽转移酶 2cDNA，并表达纯化了谷胱甘肽转移酶2，并进一步揭示了基于此多核苷酸与多肽的应用。
技术实现思路
本专利技术在提供分离的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2及其制备与应用的基础上，提供一种华支睾吸虫病TRFIA诊断试剂盒。本专利技术公开了一种分离的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2，它是具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2编码 DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA 合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的Iac或trp启动子；入噬菌体PL 启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRS和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞大肠杆菌BL21/DE3 ；或是低等真核细胞， 如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0， COs. 293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。前述分离的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的制备方法，一般来说有以下步骤(1) 用编码本专利技术的华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；( 在合适的培养基中培养的宿主细胞； (3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本专利技术的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法〔如温度转换或化学诱导) 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理〔盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。根据本专利技术实施例列举的，一个恰当的制备华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的方法为1)将华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2的编码基因克隆入原核表达载体 pET-30a(+)；2)将重组的表达载体转化大肠杆菌BL21/DE3感受态细胞后筛选阳性克隆；3)大肠杆菌BL21/DE3的诱导表达；4)收集大肠杆菌BL21/DE3的诱导表达后的培养液上清，经亲和层析获得纯化的蛋白。上述华支睾吸虫谷胱甘肽转移酶2可用于制备华支睾吸虫病诊断试剂盒。华支睾吸虫病的诊断除了常规的病原生物学检查，主要的方法是使用免疫学诊断试剂盒。主要有两类酶联免疫试剂盒(ELISA)和快速免疫胶体金试剂盒(ICT)。华支睾吸虫病的诊断即可通过检测血清或尿液中的循环抗原判断现症感染，也可通过检测血清或唾液中的特异性抗体来快速筛查。由于华支睾吸虫主要是寄生在组织外，所产生的抗原成分绝大部分随着胆汁排入肠道，只有感染度高，虫体对胆管阻塞严重，引起胆管上皮严重破损时，其分泌排泄物才能进入肝脏和外周血中。进入外周血中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐劲，余新炳，吴英松，邓传欢，董志宁，王征，李来庆，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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