黑鲷抗菌肽表达载体与构建方法及表达产物与制备方法，涉及鱼类基因工程。根据获得的黑鲷抗菌肽AS-hepc2?cDNA序列，用pET28a+原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达AS-hepc2前体肽融合蛋白得可溶性表达产物，经亲和层析纯化后得目的蛋白，用以测定抗菌活性。构建的BL21(DE3)(pET28a/AS-hepc2)表达产物无需经过P3C蛋白酶切割标签，只需通过一次亲和纯化即可获蛋白纯品，简化操作步骤，降低操作成本，快速获得可溶性纯品蛋白。构建的BL21(DE3)(pET28a/AS-hepc2)表达体系再诱导表达5h，经镍亲和纯化后获得的蛋白纯品量可为二者的10～50倍，表达效率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中的鱼类基因工程，尤其是涉及黑鲷抗菌肽Ofepcidin) 表达载体与构建方法及表达产物与制备方法。
技术介绍
抗菌肽是海洋动物先天免疫系统的重要组成成分。研究、开发与应用抗菌肽，将有效解决海水养殖生产中面临的细菌耐药性问题，并将改善由于养殖饲料中滥用抗生素造成的水产品药物残留和水环境污染等问题，具有重要的科学意义和实际应用价值。H印cidin是一类C端保守位点富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽。本申请人(1. Ming Yang, Ke-Jian Wang, Jun-Hui Chen, Hai-Dong Qu, Shao-Jing Li. Genomic organization and tissue-specific expression analysis of hepcidin-like genes from black porgyFish Shellfish Immun, 2007, 23 1060-1071)于 2007 年报道从我国养殖黑鲷中克隆获得了 7个h印cidin-like基因(AS_h印c 1 7)，在细菌人工感染下黑鲷抗菌肽 hepcidin mRNA的表达量明显上升，说明了该抗菌肽在黑鲷体内具有重要的免疫作用。并且在蛋白水平上证实了人工合成的AS-h印c2和AS-h印c6成熟肽对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌均具有杀伤作用(2. Ming Yang, Bei Chen, Jing-Jing Cai，Hui Peng，Ling-Cai， Jian-Jun Yuan,Ke-Jian Wang. Molecular characterization of hepcidin AS_hepc2 and AS~hepc6 in black porgy(Acanthopagrus schlegelii) :Expression pattern responded to bacterial challenge and in vitro antimicrobial activityComp Biochem Physiol BBiochem Mol Biol.,2011,158(2) :155_163)。黑鲷AS-h印c2是肝脏特异性表达的h印cidin变体，其基因(GenBank accession numbers :AY669377)由267个碱基组成，编码88个氨基酸。同其他已经发现的h印cidin 抗菌肽结构一样，AS-hepc2由N端的信号肽(前24个氨基酸)，前导肽(40个氨基酸)和位于C端的成熟肽(24个氨基酸)组成。AS-hepc2前体肽曾经由大肠杆菌原核表达体系 ToplOF' (pTrc-CKS/hepcidin) (3.王克坚，杨明，蔡晶晶.黑鲷抗菌肽H印cidin的表达载体和表达产物及其构建制备方法.中国专利200710008862，2007-4-20)以及毕赤酵母真核表达体系GSllSblCgK/AS-t^pd) (4.蔡晶晶，杨明，蔡灵，郭庆，潘瑞珍，王克坚.黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性.厦门大学学报(自然科学版)， 2009,48(5) 738-743)获得体外表达产物。但由于获得蛋白纯品工序复杂或技术有限等原因，造成了获得的重组抗菌肽hepcidin得率不高，或者抗菌谱研究不充分。因此，需建立更加高效的AS-h印c2基因表达载体，从而获得大量表达产物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种。黑鲷抗菌肽AS-h印c2的基因序列为3ggctcattca ctgaggtgca agagccggag gagccaatga acaatgagag tccagttgct 60gcacatgaag agaagtcaga ggagtcctgg aagatgccgt ataacaacag acacaagcgc 120agccccgctg gttgtcgctt ttgctgcggt tgctgtccta acatgagagg atgtggtgtc 180tgctgcaggttc192黑鲷抗菌肽AS-h印c2的氨基酸序列为Gly Ser Phe Thr Glu Val Gln Glu Pro Glu Glu Pro Met Asn Asn Glu151015Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu Lys Ser Glu Glu Ser Trp Lys Met202530Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly Cys Arg Phe Cys354045Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Arg Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe505560所述黑鲷抗菌肽AS-h印c2的制备方法包括以下步骤 1)构建黑鲷抗菌肽AS-h印c2的重组表达载体；2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即黑鲷抗菌肽AS-h印c2前体肽蛋白。在步骤1)中，所述表达载体选用pET28a+。在步骤2)中，所述宿主细胞可为大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLys等。在步骤3)中，所述分离纯化的具体方法为将诱导表达后菌体进行超声破碎，离心收集超声破碎后上清液，进行亲和层析纯化。本专利技术根据获得的黑鲷抗菌肽AS-h印c2 cDNA序列，利用pET28a+原核表达载体， 在大肠杆菌中诱导表达AS-hepc2前体肽融合蛋白，获得可溶性表达产物，经过亲和层析纯化后得到的目的蛋白，用以测定抗菌活性，为研究黑鲷h印cidin功能以及应用奠定基础。以往构建的大肠杆菌原核表达体系ToplOF，(pTrc-CKS/hepcidin)需经过P3C蛋白酶切割CKS标签并二次纯化后才能获得h印Cidin蛋白纯品。本专利技术构建的BL21 (DE3) (pET28a/AS-hepc2)表达产物无需经过P3C蛋白酶切割标签，只需通过一次亲和纯化即可获得蛋白纯品，大大简化了操作步骤，降低了操作成本，更加快速地获得可溶性纯品蛋白。 同时，原核表达体系ToplOF，(pTrc-CKS/hepcidin)由于需要经过二次纯化，蛋白损失较大，最终获得的纯品蛋白量较低。毕赤酵母真核表达体系GS115(pIC9K/AS-h印c2)在诱导表达后120h后蛋白表达量也仅为1. lmg/L(4.蔡晶晶，杨明，蔡灵，郭庆，潘瑞珍，王克坚.黑鲷抗菌肽h印cidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性厦门大学学报(自然科学版)，2009，48 (5) :738-743)，本专利技术构建的 BL21(DE3) (pET28a/AS-hepc2)表达体系再诱导表达5h，经镍柱亲和纯化后获得的蛋白纯品量可为二者的10 50倍，大大提高了表达效率。所述原核表达的黑鲷AS-h印c2融合蛋白能够选择性抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长，例如革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus, luteus)及革兰氏阴性菌荧光fi单胞菌(Pseudomonas fluor本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王克坚，陈贝，曲海东，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：
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