本发明专利技术提供一种含多克隆位点的互补双链核苷酸序列，包含该双链核苷酸序列的重组质粒，所述重组质粒的构建方法。所述双链核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如式1和式2所示：5’-(X)n1GAGACC(X)n2TTTAAA(X)n3GGTCTC(X)n4-3’(式1)，5’-(Y)n5GAGACC(Y)n6TTTAAA(Y)n7GGTCTC(Y)n8-3’(式2)。包含该双链核苷酸序列的重组质粒为多用途表达载体，可以用于表达miRNA和蛋白质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体而言，本专利技术涉及一种含多克隆位点的双链核苷酸序列，包含该双链核苷酸序列的重组质粒，所述重组质粒的构建方法。
技术介绍
miRNA是真核生物中一类长度约为22个碱基的核苷酸，是参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。成熟的miRNA是由较长的可折叠形成发卡结构的前体转录物经过 Dicer酶或类似于Dicer酶的内切核酸酶加工形成的。miRNA基因存在于基因组的间隔区域或者内含子当中，这些小分子的RNA通过碱基配对与靶mRNA序列的3’MTR区结合来调控基因的表达。目前人们对miRNA的生物合成过程已经了解比较清楚。简单而言，所述合成过程包括细胞内编码的miRNA的基因首先在RNA聚合酶II的作用下发生转录，从而形成长度约为几百个核苷酸的初级转录产物pri-miRNA ;初级转录产物在RNaseIII家族酶—— Drosha的参与下被加工成只含60_70nt具有莖环结构的单个miRNA前体pre_miRNA,然后在另一个RNaseIII家族酶——Dicer的参与下，miRNA前体被加工为双链的miRNA，随后接连形成单链成熟的miRNA。miRNA的转录所需的转录酶与蛋白表达所需的转录酶都属于RNA 聚合酶II，因此可以使用同一个II型转录启动子。目前较为常用的miRNA表达载体一般是利用某一特定的miRNA基因的 5’ -flanking region和3’ -flanking region作为克隆位点来连接体外合成发卡形状的 miRNA的前体。由于miRNA在基因组中的位置的特殊性，决定了在体外情况下，普通的miRNA 表达载体中无法插入外源蛋白进行表达。这就限制了载体的用途。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的一个目的是提供一种用于构建既能够表达 miRNA又能够表达蛋白的重组质粒的双链核苷酸序列。本专利技术的另一个目的是提供包含所述双链核苷酸序列的重组质粒，该重组质粒既能够表达miRNA又能够表达蛋白。本专利技术的又一个目的是提供该重组质粒的构建方法。本专利技术的技术方案如下一方面，本专利技术提供一种双链核苷酸序列，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如式I和式2所示5，-⑴ nlGAGACC ⑴ JITAAA ⑴ n3GGTCTC ⑴ n4_3’(式 I)5，- (Y) n5GAGACC (Y) n6TTTAAA (Y) n7GGTCTC (Y) n8_3 ’(式 2)其中，所述式I中的X为A、T、C或G，nl为I至20的整数，n2为I至20的整数，n3 为I至20的整数，n4为I至20的整数，条件是(X)nl, (X)n2, (X)n3或(X)n4均不包含GAGACC, TTTAAA 或 GGTCTC ；所述式2中的Y为A、T、C或G，n5为I至20的整数，n6为I至20的整数，n7为 I至20的整数，n8为I至20的整数，条件是(Y)n5, (Y)n6, (Y)n7或(Y)n8均不包含GAGACC, TTTAAA 或 GGTCTC ;并且Xil = Xil, (X)n2 与(Y)n7 互补；n3 = n6, (X)n3 与(Y)n6 互补。优选地，n2和n7为6至20的整数；n3和n6为6至20的整数。优选地，所述(X)nl为TGCTG，所述(X)n4为A ;优选地，所述(Y)n5为CCTGT，所述(Y)n8为C。根据本专利技术的具体实施方式，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别如SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示(SEQ ID NO. I)5’ -TGCTGGAGACCGAATTCTTTAAACTGCAGAAGCTTGGTCTCA-3’(SEQ ID NO. 2)5’ -CCTGTGAGACCAAGCTTCTGCAGTTTAAAGAATTCGGTCTCC-3’根据本专利技术的具体实施方式，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别还可以如 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示(SEQ ID NO. 3)5’ -TGCTGGAGACCCTACTTCTTTAAAGTGTAAGAAGCTTGGTCTCA-3’(SEQ ID NO. 4)5’ -CCTGTGAGACCAAGCTTCTTACACTTTAAAGAAGTAGGGTCTCC-3’根据本专利技术的具体实施方式，所述核苷酸序列的两条单链核苷酸序列分别还可以如 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示(SEQ ID NO. 5)5’ -TGCTGGAGACCGCACATGTCTTTAAACTGCTAGCTTGGTCTCA-3’(SEQ ID NO. 6)5’ -CCTGTGAGACCAAGCTAGCAGTTTAAAGACATGTGCGGTCTCC-3’另一方面，本专利技术提供一种重组质粒，所述重组质粒包含上述任一双链核苷酸序列。优选地，所述重组质粒为包含上述任一双链核苷酸序列的序列如SEQID NO. 10所示的质粒pcDNA6. 2-EmGFP-mir (重组质粒pcDNA6. 2-EmGFP-PL)，其结构如图I所示。根据本专利技术的具体实施方式，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO. 7所示(重组质粒 pcDNA6. 2-EmGFP-PLI)。根据本专利技术的具体实施方式，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO. 8所示(重组质粒 pcDNA6. 2-EmGFP-PL2)。根据本专利技术的具体实施方式，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO. 9所示(重组质粒 pcDNA6. 2-EmGFP-PL3)。又一方面，本专利技术提供上述重组质粒的构建方法，所述方法包括以下步骤I)分别合成上述双链核苷酸序列的两条单链核苷酸序列，然后将两条单链核苷酸序列退火形成所述双链核苷酸序列；以及2)将经步骤I)得到的双链核苷酸序列插入到质粒中，以形成所述重组质粒。优选地,所述步骤2)包括连接经步骤I)得到的双链核苷酸序列和经线性化的质粒，用获得的连接产物转化宿主细胞，然后从宿主细胞获得所述重组质粒。根据本专利技术的具体实施方式，在步骤I)中，通过HPLC方法纯化双链核苷酸序列， 退火条件包括95°C水浴后缓慢降温至室温。可以采用T4DNA连接酶连接双链核苷酸序列与经线性化的载体质粒。所述宿主细胞可以为细菌细胞，例如T0P10。普通的miRNA表达载体中无法插入外源蛋白基因进行表达，这限制了该类载体的用途。和现有技术相比，本专利技术通过在miRNA载体中引入含多克隆位点的核苷酸序列，从而提供了一种多用途表达质粒，实验证明该重组质粒即可以用于表达miRNA，也可以用于表达蛋白质。具体而言，本专利技术在miRNA表达载体的5’ -flanking region和 3’ -flankingregion克隆位点处连接了包含特定的多克隆位点的核苷酸序列。其中，核苷酸序列中的克隆位点之一BsaI可以用于利用BsaI DNA内切酶的特殊切法而轻松地切出原来的 5’-flanking region 和 3’-flanking region 连接 pre-miRNA 的克隆位点，且同时不破坏核苷酸序列，因此可以通过连接表达miRNA的基因而表达miRNA。同时利用该核苷酸序列中的另一克隆位点DraI,可以切除掉m本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：盛望，陈学斌，周邵梅，曾毅，李泽琳，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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