本发明专利技术涉及DNA亚硫酸氢盐转化的改进方法。将变性溶剂、新的反应条件以及新的纯化方法组合在一起，亚硫酸氢盐转化的效果得到了明显提高。接下来可以通过不同的方法分析被转化的DNA。本发明专利技术有助于对胞嘧啶甲基化的分析。
【技术实现步骤摘要】
改进的DNA亚硫酸氢盐转化本分案申请是基于申请号为200480029442. 3，申请日为2004年10月11日，专利技术名称为“改进的DNA亚硫酸氢盐转化”的中国专利申请的分案申请。
技术介绍
本专利技术涉及DNA中胞嘧啶甲基化的检测方法。5-甲基胞嘧啶是真核细胞DNA中最常见的共价修饰碱基。例如，它在转录调控、遗传印记和肿瘤发生中起作用(综述参见 Millar 等人Five not four :History and significance of the fifth base.在 S. Beck 和 A.01ek，eds. :The Epigenome. Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3-20) 因此 5-甲基胞嘧啶作为遗传信息组分的鉴定是非常有意义的。但是不能通过测序鉴定5-甲基胞嘧啶的位置，原因是5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，在PCR扩增时， 5-甲基胞嘧啶携带的后生信息(印igenetic information)完全丢失。对甲基化分析的通常方法基本上依据两个不同的原理操作。或者使用甲基化特异的限制酶，或者对未甲基化的胞嘧啶进行选择性的化学转化(亚硫酸氢盐处理)成尿嘧啶。然后对经过酶学或者化学预处理的DNA进行扩增，可以用不同的方法进行分析(综述参见 Fraga 禾口 Esteller :DNA Methylation :A Profile of Methods and Applications. Biotechniques 33 :632-649, Sept. 2002). WO 02/072880 pp.Iff)。因为甲基化特异的酶的使用只限于含有被所述酶识别的限制位点的某些序列，所以对于大多数应用进行的是亚硫酸氢盐处理(综述参见US 10/311,661)。根据本专利技术“亚硫酸氢盐反应”、“亚硫酸氢盐处理”或者“亚硫酸氢盐方法”指的是在亚硫酸氢根离子存在的条件下将核酸中的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基的反应， 而5-甲基胞嘧啶基本上没有转化。亚硫酸氢盐反应含有脱氨基步骤以及脱磺酸基步骤， 这两步可以分别或者同时进行(在EP1394172A1中描述了进一步的细节并且显示了反应方案，该文献的全部在此引用作为参考)。有各种不同的文献讨论了亚硫酸氢盐反应的特殊方面，包括 Hayatsu 等人，Biochemistry 9(1970)2858-28659 ；Slae 和 Shapiro, J. Org. Chem. 43(1978)4197-4200 ；Paul in 等人，Nucl. Acids Res. 26(1998)5009-5010 ； Raizis ^ A, Anal Biochem. 226(1995),161-1666 ；Wang ^ A Nucleic Acids Res. 8(1980)4777-4790。这些文献在EP 1394172A1中给予总结(在此引用其全部作为参考)。亚硫酸氢盐处理通常按照以下的方式进行分离基因组DNA，用机械或者酶学方法使其片段化，氢氧化钠变性，使用浓亚硫酸氢盐溶液转化几个小时，最后脱磺酸基和脱盐 (例如Frommer等人:A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 1 ；89 (5) :1827-31 ；在此引用其全部作为参考)。最近开发出了亚硫酸氢盐方法的几种技术改进。琼脂糖小珠法将研究的DNA加入到琼脂糖基质中，这样防止了 DNA的扩散和复性(亚硫酸氢盐只与单链的DNA反应)， 并且所有的沉淀和纯化步骤被快速透析所替代(Olek A.等人A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis,Nucl. Acids Res. 1996,24，5OM-5O66)。在专利申请 1001/985沘(=DE IOO299I5 ;= US 申请 10/；311，66I)中，描述了亚硫酸氢盐转化，其中在变性剂和/或溶剂以及至少一种清除剂(scavenger)存在下， DNA样品与浓度范围在0. lmol/L到6mol/L的亚硫酸氢盐溶液共同温育。在所述的专利申请中描述了几种适宜的变性剂和清除剂(文献的全部在这里引用作为参考)。在专利申请 WO 03/038121( = DE 10154317 ；= 10/416,624)中，公开了在亚硫酸氢盐处理过程中将要被分析的DNA结合到固相表面的方法。因此有助于纯化和洗涤步骤的进行。在专利申请 EP1394173A1和EP1394172A1 (其整体在这里引用作为参考)中描述了进一步的改进。但是亚硫酸氢盐处理中的主要问题是需要长的反应时间，以确保完全转化并且排除假阳性结果。但是由于长的反应时间，这同时导致DNA的降解。更高的反应温度的确产生更高转化率，但是也产生更为强烈的DNA降解。最近对温度、反应时间、转化率以及降解之间的相互作用进行了系统的研究。这样能够表明最高的转化率在温度为55°C (反应时间在4到18小时之间)和95°C (反应时间为1小时)时获得。但是一个严重的问题时在这一过程中DNA的降解。在反应温度为55°C时，84-96%的DNA被分解。95°C时降解实际上更高(Grunau 等人Bisulfite genomic sequencing :systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1 ；29 (13) :E65_5 ; 其全部在这里引用作为参考)。因此，大多数作者使用的反应温度是大约50°C (参见 Frommer等人，在上述引文中1992,p. 1827 ；Olek等人，在上述引文中1996,p. 5065 ；Raizis et al :A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20 ；226(1) :161_6，162)。除了高的DNA降解率，在传统的亚硫酸氢盐方法中还有另外一个问题，即至今还没有描述对转化后DNA的强有力的纯化方法。许多作者使用沉淀(参见Grimau等人，在上述引文中)。也已经有通过DNA结合表面进行的纯化(参见Kawakami等人 Hypermethylated APC DNA in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma. Journal of the National Cancer Institute, Vol.92, No. 22,2000, pp. 180本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：K·博林，M·保豪瑟，K·卡顿，
申请(专利权)人：EPI基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：
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