一种动物组织脂肪氧化酶活性的定量检测方法技术

本发明专利技术提供了一种动物组织脂肪氧化酶活性的定量检测方法，具体步骤为：(1)配制粗酶液和底物液；(2)于粗酶液中加入10倍体积的底物液，在20～30℃水浴缓慢震荡，反应20～30min，加入4倍粗酶液体积的无水乙醇终止反应，离心，取上清液0.5mL加入2mL无水乙醇，并用7.5mL质量浓度为60％乙醇稀释成测定液，并制备空白对照液，于234nm处测定吸光度；(3)绘制脂肪氧化酶酶活力与吸光度的标准曲线，将测得的吸光度与反应体系中脂肪氧化酶浓度相对应，根据脂肪氧化酶标准样品的酶活力单位，将不同样品的脂肪氧化酶活力进行量化。本发明专利技术的定量检测方法灵敏度高，稳定性和重现性好，操作方便，对设备要求低，且避免了底物液和粗酶液对测定带来的干扰。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，该方法可以对多种动物组织的脂肪氧化酶进行精确的定量分析，为富含脂质特别是富含多不饱和脂肪酸的动物组织的脂质氧化特性及产品保藏性能提供理论及技术支持，满足科研工作的需要。
技术介绍
脂肪氧化酶(Lipoxygenases，LOXs ；EC 1. 13. 11. 12)是一种含非血红素铁的双加氧蛋白酶，专一催化具有顺，顺-1，4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸及酯的氧化，形成具有共轭双键的过氧化氢衍生物，其在动植物组织及多种微生物中普遍存在。随着人们生活水平的提高，动物性食品在人们的日常膳食中所占的比例逐步增力口，然动物性食品富含脂质，特别是许多动物组织富含多种不饱和脂肪酸，在运输和贮藏期间，不饱和脂肪酸容易发生氧化，导致动物性食品脂质氧化劣变，并且一些氧化产物如脂肪酸氢过氧化衍生物和自由基，还可能引发多种人类疾病。脂肪氧化酶催化具有顺，顺-1， 4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸及酯的氧化，形成具有共轭双键的过氧化氢衍生物，其催化反应过程中产生的自由基又将加速脂质自氧化进程。因此，明晰脂肪氧化酶与动物性食品的耐储性关系是解决动物性食品耐储性问题的关键，并且我们可以深入探讨脂肪氧化酶与各种油脂的氧化之间的关系，为整个油脂行业提供可靠的理论依据。脂质的氧化一直是困扰着食品行业的一个世界性难题，长期以来有关动物性食品的保鲜、耐储性研究也不少，但关于脂肪氧化酶在动物性食品脂肪代谢中的作用及机制国内外研究甚少。对动植物脂肪氧化酶的研究主要集中在豆科植物的腥味产生机理及脂肪氧化酶的氧化漂白应用方面，对其与动物性食品的耐储性研究较少。由于脂肪氧化酶本身的作用特点及其在不同动物组织的酶含量差异，一种简便、稳定而精确的脂肪氧化酶定量检测方法的缺乏是制约广大研究人员对动物性食品的耐储性研究的瓶颈。文献中报道的脂肪氧化酶测定方法很多，但目前尚无公认而统一的方法。通常多用氧电极法、碘量法、显色法、紫外分光光度法、等方法来检测1氧电极法根据基质浓度一定，反应体系中的溶解氧浓度的变化与酶活力大小呈线性相关的原理进行测定，即由于脂肪氧化酶催化耗氧，溶液中氧浓度的减少速率与酶活力大小成正比，利用氧电极可以测定酶活力，此方法灵敏度极高，但测定时要严格控制温度，并且要求脂肪酸底物充分乳化，但乳化后脂肪酸的表面活性会对LOXs的反应及活性测定带来干扰。2碘量法根据脂肪氧化酶催化不饱和脂肪酸氧化生成的过氧化物具有较强的氧化性，能将Γ离子氧化成12，然后用Na2S2O8标准溶液滴定释放的游离碘。但是生成的过氧化物种类多种多样，有些过氧化物如二羟基过氧化物对Γ离子的反应活性很低，故对于过氧化物含量很低的样品，碘量法不灵敏，且取样量大，应用范围受到很大的限制。3显色法1943年，Sumner根据脂肪氧化酶含有铁原子的事实建立了一种以亚油酸为底物的硫氰酸铁法，即显色法。具有很强的还原能力，自身被氧化成后，Fe3+与硫氰酸根离子(SCN-)生成血红色的络合物，在400 650nm范围类有强的光吸收峰，因此可以通过检测过氧化产物的量来反映脂肪氧化酶的活性。但由于硫氰酸铁易聚合导致红色褪去，且反应条件难于控制，此法的应用受到限制。4分光光度法根据脂肪氧化酶催化不饱和脂肪酸氧化生成的氢过氧化物的共轭二烯基团在234nm处有特征吸收的特征，以反应体系在234nm处的吸光度值的增加速率定义脂肪氧化酶的活性。向脂肪酸底物溶液中加入吐温-20和NaOH可使脂肪酸底物很好的溶解，且对脂肪氧化酶的测定无干扰。因此，分光光度法成为目前普遍适用且操作简单的脂肪氧化酶测定方法。目前用分光光度法定量检测脂肪氧化酶活性常用以下两种方法定义酶活力(1)以脂肪酸底物和脂肪氧化酶的混合反应液的吸光度与脂肪酸底物液的吸光度之差作为脂肪氧化酶催化脂肪酸氧化的程度，即脂肪氧化酶的活性。被减数定义为酶促氧化值，减数定义为自养化值。具体方法是于含2. 47mL提酶缓冲液和0. 5mL底物液的混合液中加入0. 03mL粗酶液制成3mL 反应液，混勻，迅速测定该体系25°C时234nm处的吸光度值(0D值)变化，每&记录一次数据，后k和前k的吸光度值分别记为0D*t+5s和0D:；底物溶液的自养化值则直接将2. 5mL 提酶缓冲液和0. 5mL的底物液混合，测定其吸光度值，每k记录一次数据，后k和前k的吸光度值分别记为0Dt+5s和0Dts。酶活性计算方法为A* = 12X /0. 01A = 12X /0. 01-A*酶活(U/g)=活性单位数(U) X定容体积(mL)/0. 03/样品质量(g)式中A为酶的活性单位数⑶；A*为底物的自氧化活性单位数⑶；0. 01为一个常数，即每分钟增加吸光度值0. 01所需的活性作为样品脂肪氧化酶的一个活性单位0. 03 为3mL反应体系中粗酶液的添加量。(2)以一定浓度的脂肪酸底物为空白，测定粗酶液和脂肪酸底物的混合反应液的吸光度值。以此吸光度值增加速率作为脂肪氧化酶的活性。具体方法为于2mmol/L的底物溶液中加入20 40 μ L的脂肪氧化酶液使最终反应体积为 3mL ；迅速测定反应体系在234nm处的吸光度值。酶活定义为25°C下ImL反应体系在234nm 处Imin内吸光度值的增值。本专利技术采用第(2)种酶活力的定义方法。以往文献中报道的脂肪氧化酶的检测方法对不同来源的脂肪氧化酶适应性低，或者灵敏度和稳定性上存在瑕疵，有的操作复杂，测定时时间难于把握，酶活定义难以统一， 给相关领域的研究带来众多不便。而目前的定量测定方法均利用脂肪氧化酶催化脂肪酸底物氧化的动态过程来反映酶活性，对于不同来源的动物组织样品和不同纯度的脂肪氧化酶溶液，反应体系的吸光值很难在短时间内呈现理想的线性增加趋势，故酶活测定时间难以把握，且操作复杂难以控制且难以保证稳定性和重复性。故一种稳定而精确定量的脂肪氧化酶测定方法是研究油脂及相关领域的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种广泛适用的动物组织脂肪氧化酶的测定方法，既适用于高纯度的脂肪氧化酶的测定，又可检测纯度较低的粗酶液的酶活力；操作方法简单易控，且能实现精确定量。该测定方法仅通过简单的步骤制备出脂肪氧化酶粗酶液，无需繁杂的分离纯化步骤，为各种动物性产品中脂肪氧化酶的测定提供简单、适用、快捷的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案是一种动物组织的脂肪氧化酶活性的定量检测方法，包括如下步骤(1)粗酶液和底物液的配制；所述粗酶液是待测的动物组织经捣碎后，用磷酸盐缓冲溶液浸提，再经两次盐析、透析纯化后得到粗酶液；所述底物液是由0. 2g 0. 3g吐温-20和0. 7mmol 0. 8mmol亚油酸在pH值为 6. 5 7. 5的磷酸缓冲液中配制成的底物液；(2)制备脂肪氧化酶样品的测定液及对照液，测定吸光度；将粗酶液中加入底物液中，加入4倍粗酶液体积的无水乙醇终止反应，离心，取上清液加入无水乙醇，并用质量浓度为60%乙醇稀释成测定液；在同样反应条件下制备空白对照液，于234nm处测定吸光度；(3)根据脂肪氧化酶酶活力与吸光度的标准曲线，得出酶活力；所述标准曲线是按照以下方案得出的配制一系列不同浓度的脂肪氧化酶标准品酶液，在步骤O)的同样反应条件下反应后，配制脂肪氧化酶标准品的测定液及对照液，于 234nm处本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永乐，王建辉，王发祥，李向红，俞健，刘冬敏，
申请(专利权)人：长沙理工大学，
类型：发明
国别省市：