本发明专利技术涉及家蚕的转基因技术，主要为增强子Hr3和启动子IE1在制备转基因干扰载体中的联合应用；转基因干扰载体的基础载体为转座载体pBac[3×P3-EGFPafm]，依次含有增强子Hr3、IE1基因启动子、目的基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin3(A3)内含子、目的基因反向片段和终止信号序列SV40；运用本技术，BmNPV病毒一旦侵染进入家蚕细胞就会受到抑制；本发明专利技术巧妙的利用IE1启动子和增强子Hr3的组合，使转基因家蚕在正常情况下表达适量的dsRNA；当BmNPV侵染家蚕后，利用病毒增殖产生的IE1蛋白激活Hr3增强子来大量表达dsRNA，使靶标基因dsRNA的表达量随着病毒量的增加而增加，最大程度减少表达dsRNA对家蚕正常生理活动的影响，并显著提高家蚕的抗性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因领域，特别涉及家蚕的转基因技术。
技术介绍
家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫，在很多发展中国家，养蚕业是农民经济收入的一个重要来源。但是，每当养蚕业遭遇病毒侵害时，蚕业生产必将受到不可挽回的巨大损失。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是对养蚕业危害最为严重的一种病原。已有研究结果表明，破坏病毒的某些必需基因，病毒将不能进行增殖。利用转基因技术抑制病毒关键基因的表达是培育家蚕抗病品种的有效策略。RNA干扰(RNAi )是指通过反义RNA和正链RNA形成双链RNA( dsRNA)分子，在mRNA 水平关闭相应序列基因的表达或使其沉默，即序列特异性的转录后基因沉默技术。RNA干扰是最近十年发展起来的操控基因表达的新的强有力的实验方法。因为RNA干扰技术利用了 dsRNA能够特异的介导靶标基因表达沉默这一在生物界本身存在的基因表达调节机制，故与其他调控基因表达的手段相比，具有高效、快速且特异性好的特点。此外，由于RNA干扰是生物体固有的古老而天然的抗病毒机制，所以RNA干扰技术用于抗病毒治疗是最直接的运用。利用转基因和RNA干扰相结合的转基因干扰技术，构建转基因干扰载体，在转基因家蚕体内持续表达能够抑制BmNPV病毒增殖的dsRNA，是制备家蚕抗病毒品种的有效方法。目前已有研究者利用IEl或者A4等组成型启动子来构建转基因干扰载体，制备转基因家蚕系统。但是，不管是否有病毒侵染，这些转基因家蚕系统体内都会有等量的dsRNA存在。因此，最优的转基因干扰载体应该是，制备的转基因家蚕在正常情况下有适量的dsRNA 表达，在病毒侵染以后，家蚕体内的dsRNA量随着病毒侵入而诱导上调表达。目前已经报道的少量关于家蚕转基因干扰抗BmNPV的研究中，都是利用组成性启动子构建转基因干扰载体，通过注射实验室用非滞育品种制备转基因家蚕系统。目前还没有利用组成诱导型启动子构建转基因干扰载体，制备家蚕实用品种转基因干扰系统的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供增强子Hr3联合启动子IEl的应用，该应用为家蚕转基因干扰载体的构建提供了新思路。本专利技术的目的之二在于提供一种转基因干扰载体，其能提高滞育家蚕品种对BmNPV病毒的抗性。本专利技术的目的之三在于提供上述转基因干扰载体的制备方法，该方法操作简单，稳定性高。本专利技术家蚕转基因干扰载体的优化方法及其应用，依次通过以下步骤实现(1)利用转座载体pBac构建包含病毒IEl启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体 pBac (pb-IGG)，包含家蚕A4启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac (pb-AGG)和包含病毒Hr3增强子、IEl启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白Actin 3内含子、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段的转基因干扰载体pBac (pb-HIGG)。(2)将家蚕932品种通过15°C低温催青解除滞育，将产下的非滞育蚕卵收集好，在蚕卵产后池-池用显微注射仪内将3-如1、总浓度为400ng/ul的混合质粒(增量表达载体和辅助质粒按1:1混合)注射进蚕卵，然后用无毒胶水将注射孔封住。(3)将完成注射的蚕卵在35%的甲醛蒸汽中消毒^iin后，置于25°C、相对湿度为 80%的环境中进行催青直到孵化，将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养，将当代(GO)的蚕蛾进行自交或者回交，将滞育性的Gl代蚕卵即时浸酸解除滞育，胚胎发育第六天在荧光显微镜下面筛选转基因阳性个体，将获得的转基因个体单蛾区正常饲养，继代扩大群体数量。(4)将转基因系统IGG、HIGG、AGG和正常932(非转基因932)经口添食感染BmNPV 病毒，设置不添食的转基因和正常932对照，连续10天统计死亡率。不同剂量病毒添食后的死亡率统计结果显示转基因系统HIGG对BmNPV病毒的抗性效果最好。(5)在攻毒后48h，IGG、HIGG、AGG和正常932各随机抽取10头蚕提取总DNA，通过荧光定量PCR检测BmNPV病毒的拷贝数，证明HIGG中的病毒含量确实远低于正常932品种。(6)调查IGG、HIGG、AGG和正常932的经济性状，各系统雌雄各随机抽取15颗茧，分别称取每颗茧的全茧量和茧壳量，计算茧层率，确定转基因系统的经济性状没有受到影响。为实现上述三种目的，本专利技术的技术方案为1增强子Hr3和启动子IEl在转基因干扰载体中的联合应用，所述增强子Hr3如SEQ ID NO: 1的核苷酸序列所示，所述启动子IEl如SEQ ID NO:2的核苷酸序列所示。2所述转基因干扰载体为以BmNPV病毒为靶标的干扰载体。3含有增强子Hr3和启动子IEl的转基因干扰载体，所述转基因干扰载体的基础载体为转座载体pBaC，所述基础载体上依次含有增强子Hr3、启动子IE1、 目的基因正向片段、单链区、目的基因反向片段和终止信号序列SV40。4根据3所述的转基因干扰载体，所述目的基因为gp64基因，gp64基因的正向片段如SEQ ID NO: 3的核苷酸序列所示，gp64基因的反向片段如SEQ ID NO:4的核苷酸序列所示。5根据4所述的转基因干扰载体，所述转基因干扰载体为pBac ，转基因干扰载体以转座载体 pBac 为基础载体，并依次含有病毒Hr3增强子、IEl启动子、gp64基因正向片段、家蚕肌动蛋白基因Actin 3内含子(A3 intron)、gp64基因反向片段和终止信号序列SV40片段。6所述的转基因干扰载体的制备方法，具体包括以下步骤 A.目的基因的正、反向片段的构建设计目的基因正向片段，其上游引物为 5' ccggaattcccgattaaacgtaaagtcgagcacc 3，，其下游弓I物为5，cgcggatccgcggggcaataaacgaccaacc 3，；设计目的基因反向片段, 其上游弓I物为 5，cccaagcttggggggcaataaacgaccaacc 3，，其下游弓|物为 5，tgctc tagagcaattaaacgtaaagtcgagcacc 3'；利用BmNPV病毒基因组为模板进行PCR扩增，分别得如SEQ ID N0:3所示的目的基因正向片段和如SEQ ID N0:4所示的目的基因反向片段；B.pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A 的构建将所述目的基因正向片段用I称BamH I进行双酶切，同时用I和 BamH /双酶切包含家蚕肌动蛋白Actin 3内含子的pMD_19载体，连接酶切片段，得 pMD-19-gp64S-A3intron载体；将所述目的基因反向互补片段和pMD-19-gp64S_A3intron 载体分别用HindIim Xba I进行双酶切并连接，得到pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A载体；C.1180-IElP-gp64S-A3intron-gp64A-SV40 载体的构建将含有IEl启动子和SV40终止信号的L4440载体和pMD-19-gp64S_A3intron-gp64A 分别用EcoR /和本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏庆友，蒋亮，王根洪，程廷才，徐汉福，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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