本发明专利技术提供了具有人血管内皮生长因子结合活性的人源重链可变区。具体地，本发明专利技术提供了来源于全人源单克隆抗体的、且具有人血管内皮生长因子结合活性的抗体单一重链可变区。该单一重链可变区作为抗体片段，不仅保留有完整免疫球蛋白的人VEGF结合活性，还可以剂量依赖性地抑制人血管内皮细胞(HUVEC)的增殖。本发明专利技术还提供了所述抗体片段的制备方法和用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，更具体地涉及一种具有人血管内皮生长因子 (humanVascular Endothelial Growth Factor,hVEGF)结合活性的人源重链可变区及其编码序列和应用。
技术介绍
血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)，也称血管渗透因子(vascular permeability factor，VPF)，是在 1989 年由 FerraraN 等发现。VEGF 是相对分子质量为(34 45) X IO3的同源二聚体糖蛋白，是目前发现的最重要的血管形成促进剂之一，对肿瘤的浸润和转移有重要影响，在肿瘤的血管发生过程中发挥极其重要的作用。VEGF的编码基因位于染色体的6q21. 3，全长14kb，含有8个外显子和7个内含子， 可以形成VEGF121、VEGF165、VEGF189, VEGF206和VEGF145等至少5种蛋白异构体。这几型VEGF生物活性相近，在人类细胞中VEGF121和VEGF165是主要的异构体形式，而多数细胞以分泌VEGF165为主，是VEGF发挥作用的主要形式。在诸多异构体中，VEGF121、VEGF145 和VEGF165均能诱导血管内皮细胞增殖和新生血管形成，但以VEGF165的活性最高。通过抑制VEGF及其受体可有效抑制肿瘤从无血管期向血管期转变，从而抑制其生长，并降低癌细胞转移的几率。FDA目前已批准两种靶向VEGF的治疗性抗体上市，即 Avastin和LUCENTIS，另有数种靶向VEGF的治疗性抗体正在不同阶段的临床实验。Avastin 自2004年上市以来被证明对于转移性直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤均有显著的抑制效果。目前几乎所有被FDA批准上市或正在进行临床实验的治疗性抗体都是人源化或嵌合IgGl抗体，具有分子量大和鼠源性两方面的缺点。大分子很难穿透组织或结合隐藏在抗原内部的抗原决定簇。抗体内的鼠源成分会引起HAMA反应(Human anti-mouse antibody)，在临床应用时导致抗体被迅速降解和清除。目前克服这些不足的主要方法是制作全人抗体和对抗体进行小型化改造(如， Fab片段、单链抗体、单域抗体、噬菌体库筛选和⑶R模拟抗体等)。其中，由单一重链或重链可变区构成的单域抗体被证明具有出众的进入抗原分子表面空隙(Cavity)的能力，同时还具有体积小、可溶性高、热稳定性好、重折叠能力强和体内组织穿透性好等优点，能够较高水平保留完整抗体的抗原识别能力和亲和力。然而，迄今为止本领域尚缺乏效果令人满意的抗VEGF的抗体，尤其是分子量小且无鼠源性的抗体。因此，本领域迫切需要开发新的分子量小且无鼠源性的抗VEGF的抗体。
技术实现思路
本专利技术的一个目的就是提供一种分子量小且无鼠源性的抗VEGF的抗体。本专利技术的另一目的就是提供所述抗体的制法和用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种单克隆抗体Vh链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID N0:3 所示的 CDR1，SEQ ID NO :4 所示的 CDR2，和SEQ ID N0:5 所示的 CDR3。在另一优选例中，它具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的Vh链的FR区是人的FR区。在本专利技术的第二方面，提供了一种具有人血管内皮生长因子结合活性的单链的重组蛋白，其中，所述的重组蛋白具有本专利技术第一方面中所述的单克隆抗体Vh链以及任选的协助表达和/或纯化的标签序列。在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。在另一优选例中，所述的重组蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列；(c)将SEQ ID NO 2或11所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有人血管内皮生长因子结合活性功能的由(a) 或(b)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的衍生序列是第4位为Ile的SEQ ID NO 2序列。在本专利技术的第三方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的蛋白质本专利技术第一方面中所述的单克隆抗体Vh链；或本专利技术第二方面中所述的重组蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸具有选自下组的DNA序列SEQ ID NO :1或10。在本专利技术第四方面，提供了一种载体，它含有本专利技术第三方面中所述的多核苷酸。在本专利技术第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本专利技术第四方面中所述的载体或者基因组整合有本专利技术第二方面中所述的多核苷酸。在本专利技术的第六方面，提供了一种制备重组多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养本专利技术第五方面中所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本专利技术第一方面中所述的单克隆抗体Vh链或本专利技术第二方面中所述的重组蛋白。在本专利技术的第七方面，提供了一种药物组合物，它含有(i)本专利技术第一方面中所述的单克隆抗体Vh链或本专利技术第二方面中所述的重组蛋白以及(ii)药学上可接受的载体。在本专利技术的第八方面，提供了本专利技术第一方面中所述的单克隆抗体Vh链或本专利技术第二方面中所述的重组蛋白的用途，它们被用于制备组合物，所述的组合物用于(a)抑制血管内皮细胞生长；(b)与人血管内皮生长因子结合；或(c)用于治疗肿瘤。在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。在本专利技术第九方面，提供了一种抑制血管内皮细胞生长或治疗与血管内皮细胞生长相关的疾病的方法，包括步骤给需要抑制或需要治疗的对象施用本专利技术第一方面中所述的单克隆抗体Vh链或本专利技术第二方面中所述的重组蛋白或本专利技术第七方面中所述的药物组合物。在另一优选例中，所述的与血管内皮细胞生长相关的疾病包括肿瘤。在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再--累述。附图说明图1显示了本专利技术一个实例中用表1引物所克隆的VH片段的琼脂糖电泳。(A)在350bp的位置获得VH的特异PCR扩增条带。(B)阳性质粒通过Xba I-Xho I和BamH I-Hind III双酶切鉴定。1 克隆I利用 Xba I-Xho I酶切；2 克隆II利用Xba I-Xho I酶切；(C) 1 克隆 I 利用 BamH I-Hind III 酶切；2 克隆 II 利用 BamH I-Hind III 酶切。图2显示了抗体VH片段序列分析和功能区划分。图3显示了本专利技术一个实例中rhVVH在BL21大肠杆菌中诱导表达情况，其中利用 SDS-PAGE分析rhVVH在BL21大肠杆菌中的诱导表达条件。各泳道如下1_2 无质粒的BL21细菌的裂解上清与沉淀作为阴性对照，37°C诱导培养3小时；3-8 重组菌37°C诱导表达；9-14 重组菌在28°本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体Vh链，其特征在于，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO 3 所示的 CDRl， SEQ ID NO 4 所示的 CDR2，和 SEQ ID NO 5 所示的 CDR3。2.如权利要求1所述的单克隆抗体Vh链，其特征在于，它具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。3.一种具有人血管内皮生长因子结合活性的单链的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有如权利要求1所述的单克隆抗体Vh链以及任选的协助表达和/或纯化的标签序列。4.如权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白选自下组(a)具有SEQID NO 2所示的氨基酸序列；(b)具有SEQID NO 11所示的氨基酸序列；(c)将SEQID NO :2或11所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有人血管内皮生长因子结合活性功能的由(a)或(b) 衍生的多肽。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：成国祥，刘思国，陈建泉，
申请(专利权)人：上海杰隆生物工程股份有限公司，上海转基因研究中心，
类型：发明
国别省市：
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