真核细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供在含碳酸氢盐的细胞培养体系中无需添加碱而维持pH在利于细胞生长的范围内的装置和方法。所述方法依赖生物反应器系统的气体传质特性来调节CO2自和向细胞培养物的传递，从而细胞培养物的pH可以被维持在期望的范围内。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在含碳酸氢盐的培养基中培养真核细胞的装置和方法，所述培养基允许在不直接向该培养基中添加碱的情况下维持细胞培养物的PH。
技术介绍
用于细胞建库、用于细胞产品的生产例如重组蛋白生产的细胞培养，受到细胞生长时条件变化的妨碍。虽然不锈钢生物反应器常被用于细胞生产，然而一次性用品 (disposables)越来越多的在生物制品的制造的所有阶段中使用(Rao等，2009)。在上游工艺中，相比不锈钢制品，一次性的生物反应器存在诸多的优势(从减少交叉污染到成本和时间的节省)。WAVE Bioreactor 是在生物医药工业中用于重组蛋白生产的一次性上游技术的一个文献充分记载的实例(Cronin等，2007 ；Haldankar等，2006 ；Ling等，2003 Je等， 2009)。由Singh (Singh，1999)所开发的WAVE Bioreactor 系统包含预先消毒的、柔性的、一次性的培养室(Cellbag )，CO2-和/或O2-空气混合控制器，和用于摇动和加热 Celling 的气动控制平台。由该平台产生的摇摆(rock)运动在Celling 中提供了混合和气体传递。WAVE Bioreactor 系统可以进一步装备以提供在线pH和溶解氧(DO)监控以及实时反馈控制(Mikola等，2007 ;Tang等，2007)。然而，对额外设备的需求以及对专门设计的以容纳PH和DO探测器的袋子的需求，增加了运营成本和系统的复杂性。另外，在pH控制生物反应器中为使培养物PH增加到规定的设定点所需要的碱加入，会增加培养物的摩尔渗透压浓度。取决于生物反应器中摩尔渗透压浓度增加的程度，在细胞增长和存活力方面的相关衰减(deZengotita等，2002 ；Zhu等，2005)可能抵消pH值控制的优势。另外，如果 PH探测器发生故障，由此产生的pH值混乱可能改变细胞代谢并促进细胞死亡(Miller等， 1988 ；Osman 等，2002)。对于某些细胞培养应用来说严格的pH值和DO控制不是必须的，诸如，例如在小规模培养系统如摇瓶和转瓶中用于细胞的维持和扩大的常规细胞传代。然而，PH值和DO的极值对细胞生长和生存力是不利的(Lin等，1993 ；Link等，2004 ；Miller等，1988 ；Osman等 2001)，并可影响产品质量(Restelli等2006 ；Yoon等，2005)。因此，对于生物制品制造的全阶段，对细胞的生长条件保持一些控制是极其重要的。研究人员先前证明，在6. 8-7. 3的 PH值范围内和在10-100 %空气饱和度的DO值范围内的CHO细胞培养是成功的(Link等 2004 ；Restelli 等 2006 ；Trummer 等 2006 ；Yoon 等 2005)。向常规生物反应器增加功能，如实时pH监测和DO监控控制，将显著增加生物制品制造中细胞培养的成本和劳动强度。另外，这些功能的失灵或者故障可导致细胞培养的不可接受的变动和潜在的损失，这是非常耗费时间和资源的。因此，需要用于培养真核细胞的改进方法，该方法将无需引入强碱以及无需额外地进行PH值和DO的监测和实时控制。专利技术概述本专利技术提供了在细胞培养系统中无需加入碱即可维持PH值的装置和方法。在含碳酸氢盐的细胞培养基中，基于碳酸-碳酸氢盐缓冲液平衡(反应式1)CO2+HOH< = = = >H2CO3< = = = >H++HCO3_pH = pK-log ([CO2] / [HCO3-])，培养基中CO2的量将影响培养基的pH值。因此，本专利技术利用这种关系，通过使用细胞培养体系中液相和气相的动态界面来增加或者减少溶解的CO2浓度，无需添加强酸或者碱，调整细胞培养基的PH值。本专利技术提供了一种用于实现此调节的方法和用于实施该方法的装置。一般地，向本专利技术的装置供给空气、氧气或者这些气体的组合，以维持细胞培养物的溶解氧。通过向装置的顶部空间提供气体混合物(可以操控其组成和引入速度)，取决于液相和气相之间不同的CO2浓度，CO2可以被加入细胞培养基也可以从中移除。从顶部空间除去CO2将增加培养PH值，这是因为培养基中的溶解CO2会扩散进入到顶部空间中。相反，当以高于培养基中的浓度向所述装置添加CO2时，CO2将溶解到培养基中并且培养pH值将减小。本专利技术提供了一种允许CO2转移入和转移出细胞培养物以维持培养pH值而无需添加碱的方法。因此，本专利技术提供了一种用于培养真核细胞的方法，包括在容器中在含碳酸氢盐的培养液中培养真核细胞，其中所述容器具有封装细胞培养物的壁和位于所述细胞培养物上方的气相顶部空间。该容器还包括至少一个提供气体自所述顶部空间进出的口(port)。 搅动该容器以提供在液相和气相之间的动态界面。可以监测培养物的PH，并且可以通过所述的口向顶部空间供应气体，其中所述气体包含一定量的CO2,以随着更多的CO2溶解到细胞培养物中而降低PH，或者可以通过该口，从顶部空间排出累积的CO2，以使细胞培养物pH 值增加。由此PH值被维持在一个预定的范围。一般地，在细胞培养基中溶解的CO2的分压维持在1至200mmHg的量。在某些实施方式中，溶解的CO2的分压为10至180mmHg。在某些实施方式中，溶解的CO2的分压为20 至150mmHg。在某些实施方式中，溶解的CO2的分压为100至180mmHg。在某些实施方式中， 溶解的CO2的分压为20至80mmHg。在某些实施方式中，溶解的CO2的分压为30至60mmHg。 在某些实施方式中，溶解的CO2的分压为35至50mmHg。在某些实施方式中，溶解的CO2的分压为40mmHg。顶部空间清除可以连续地或间歇地进行。一般地，DO值维持在10%以上。在某些实施方式中，DO值维持在20%以上。在某些实施方式中，DO值维持在30%以上。在某些实施方式中，DO值维持在40%以上。在某些实施方式中，DO值维持在50 %以上。在某些实施方式中，DO值维持在60 %以上。在某些实施方式中，气体进入容器的流速是每分钟0. 001顶部空间体积(hvm)。在某些实施方式中，气体进入容器的流速是0. 005hvmo在某些实施方式中，气体进入容器的流速是O.Olhvm。在某些实施方式中，气体进入容器的流速是0.02hvm。在某些实施方式中， 气体进入容器的流速是0.05hvm。在某些实施方式中，气体进入容器的流速是0. lhvm。在某些实施方式中，气体进入容器的流速是0. 2hvm0在某些实施方式中，气体进入容器的流速是Ojhm。在某些实施方式中，气体进入容器的流速是0.9hvm。在某些实施方式中，气体进入容器的流速是1. Ohvm。真核细胞可以是脊椎动物细胞，例如但不限于青蛙、兔、啮齿动物、绵羊、山羊、狗、 猫、牛、马、猪、非人类灵长类动物或人类的细胞。该方法可以在具有硬的或者可塑的壁的容器中进行，例如塑料容器或者一次性培养袋。所述的容器可以通过任何能够在容器中提供液相和气相之间的动态界面的工具来搅动。这种搅动(agitation)可以是例如摇摆(rocking)、定轨运动(orbital motion), 八字形运动、转动、振荡(shaking)等。在某些实施方式中，搅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.06 US 61/223,3131.一种用于分批培养真核细胞的方法，包括向容器中提供包含在含碳酸氢盐的培养液中的真核细胞的细胞培养接种物，所述的容器具有封装所述细胞培养物的壁和位于所述细胞培养物上方的气相顶部空间，并且其中所述容器包含至少一个提供气体进出所述顶部空间的口；搅动所述的容器；和通过所述口向所述顶部空间提供气体，其中所述的气体包含一定量的C02，并且其中为了维持所述细胞培养物的预定PH，随时间调节在所述气体中所述C02量以调整所述细胞培养物的PH。2.权利要求1所述的方法，其中所述的搅动是以15-30rpm的摇摆速度和5°-15°的摇摆角度，摇摆所述容器。3.权利要求2所述的方法，其中摇摆速度在19-25rpm之间，摇摆角度在8°-12°。4.权利要求1所述方法，其中所述C02以所述气体的10%和0%(ν/ν)之间的量提供。5.权利要求4所述的方法，其中所述C02以所述气体的8%和2%(ν/ν)之间的量提{共。6.权利要求5所述的方法，其中所述C02在第1天以所述气体的8%(ν/ν)的量提供， 在第2天以所述气体的5% (ν/ν)的量提供，并且此后以所述气体的2% (ν/ν)的量提供。7.权利要求1所述的方法，其中所述气体流速在0到1.Ohvm。8.权利要求7所述的方法，其中所述气体流速在0.001和0. 002hvm之间。9.权利要求8所述的方法，其中所述气体流速是0.007hvm。10.权利要求1所述的方法，其中所述的真核细胞是脊椎动物细胞。11.权利要求10所述的方法，其中脊椎动物细胞选自蛙细胞、兔细胞、啮齿动物细胞、 绵羊细胞、山羊细胞、狗细胞、猫细胞、牛细胞、马细胞、非人类灵长类动物的细胞和人细胞。12.一种用于灌流培养真核细胞的方法，包括向容器中提供包含在含碳酸氢盐的培养液中的真核细胞的细胞培养接种物，所述的容器具有封装所述细胞培养物的壁和位于所述细胞培养物上方的气相顶部空间，并且其中所述的容器包含至少一个提供气体进和出所述顶部空间的口 ；搅动所述的容器；将新鲜培养基灌流到所述容器中，并且从所述容器中移除废培养基；通过所述口向所述顶部空间提供气体以从所述容器的顶部空间扫出累积的C02，由此调节所述细胞培养物的PH，以维持所述细胞培养物的预定pH。13.权利要求12所述的方法，其中所述的搅动是以15-30rpm的摇摆速度和5°-15° 的摇摆角度，摇摆所述容器。14.权利要求12所述的方法，其中摇摆速度在19-25rpm之间，摇摆角度在8°-12°。15.权利要求1所述方法，其中所述的气体包含所述气体的0%和50%(ν/ν)之间的量的02。16.权利要求15所述的方法，其中所述02以所述气体的20%和40%(ν/ν)之间的量提供。17.权利要求12所述的方法，其中02在第1和2天以所述气体的0%(ν/ν)的量提供， 并且此后以所述气体的30% (ν/ν)的量提供。18.权利要求12所述的方法，其中所述气体流速在0到1.Ohvm。19.权利要求18所述的方法，其中所述气体流速在0.001和0. (^hvm之间。20.权利要求19所述的方法，其中所述气体流速是0.Oawm。21.权利要求12所述的方法，其中所述的真核细胞是脊椎动物细胞。22.权利要求21所述的方法，其中脊椎动物细胞选自蛙细胞、兔细胞、啮齿动物细胞、 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·巴斯卡尔，J·熊，WL·S·梁，I·H·尤克，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：