产生双单倍体植物的方法技术

本发明专利技术涉及用于产生双单倍体植物的方法，包括用含一个功能性精细胞的花粉使非中央细胞的胚囊细胞受精；使中央细胞增殖成胚乳；然后从胚乳再生出双单倍体植物。含一个功能性精细胞的花粉是例如突变体花粉，它可通过化学突变、用核酸转化或辐照获得。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及产生双单倍体植物的新方法。本专利技术进一步涉及由此获得的植物以及这些植物的后代、细胞、组织和种子。自从Guha和Maheshwari在1964年(Nature 204 :497)发现植物可再生自单倍体孢子，已完成了许多研究来获得关于其它物种的相似认识(参阅例如"^ vitro Haploid production in Higher plants" Vol. 1，2，3，4，5，Eds :S.Jain, S.Sopory and R.Veilleux(1996)Kluwer Academic Publishers)。现在，为了加速产生基因纯系并且也为了评估和监测难于了解的特性诸如那些由多基因/等位基因编码的特性，使用双单倍体(double haploid, DH)的现代植物育种已成为非常有用的工具。在繁殖农作物中产生和使用DHs对许多物种而言是众所周知的(参阅例如Thomas W. et al. (2003), In :Doubled Haploid production in crop plants. A Manual. Eds. M.Maluszynski, K. Kasha, B. Forster and I.Szarejko. Kluwer Academic Publishers, pp 337-349)。现在为止，DHs可获自雄性或雌性器官的孢子。来自雄性器官的孢子被称为小孢子，而体外培养物被称为小孢子培养物。长期以来在芸苔中已很好地建立了典型小孢子培养物(参阅例如 Keller et al. (1984) In :K. Giles, S. Sen (eds.), Plant Cell Culture in Crop Improvement ppl69_183. Plenum Pub. Corp. , New York)。来自雌性器官的孢子被称为大孢子，并且这些孢子的体外培养通常被称为雌核生殖(gynogenesis)。对于例如糖甜菜以及黄瓜而言雌核生殖是一项成熟的技术(参阅例如Hosemans D.and Bossoutrot, Ζ.Pflanzenzuchtg. 91 :74-77(1983) ；EP O 374 755)。尽管有许多技术进步，雌核生殖和小孢子培养二者的成功仅限于一些顺应性较高的基因型。不仅存在对于产生DHs而言成功率低的植物种类诸如西瓜(Sari N. , Hort. Science 1994，vol. 29(10), 1189-1190)和南瓜(Kurtar Ε. S. et al.，Euphytica, Volume 127 (3)，2002，335-344 (10)，一些物种对DHs的诱导完全抵制。这意味着DHs的巨大利益不能被用于每一种期望的植物种类。因此本专利技术的目标是提供适于产生DHs的新方法。此目标通过包含以下步骤的用于得以实现a)用有一个功能性精细胞的花粉对非中央细胞的胚囊细胞授精；b)使中央细胞增殖成胚乳；c)从胚乳再生双单倍体植物。本专利技术没有通过直接使用小孢子或大孢子获得DH植物。相反，所述DH植物再生自雌性配子体的中央细胞。被子植物中有性生殖的特点是被称为双重受精的独特过程。这意味着来自花粉粒的两个精细胞进入雌配子体。然后第一个精细胞将使单倍体卵细胞受精，而第二个精细胞将使包含两个核的中央细胞受精。从受精卵细胞将发育出二倍体胚芽，而从中央细胞将增殖出三倍体胚乳。不使中央细胞受精以及/或者没有来自受精卵细胞的引发，中央细胞通常不会增殖成胚乳。唯一的例外是可产生自主胚乳发育的fis和fie突变体。不过，在本专利技术中，其中精细胞之一缺失或失活的突变体花粉将只使卵细胞受精。 在缺失第二个精细胞时中央细胞将保持未受精，并因此保持在二倍体阶段，它在本质上是双单倍体。卵细胞受精将引发未受精的中央细胞增殖成胚乳。由此可使用对于许多植物种类可广泛获取的适于从胚乳再生三倍体植物的技术(参阅τ. D. Thomas&R. Chaturvedi, Plant Cell Tissue and Organ Culture 93 :1)来从未受精中央细胞产生双单倍体植物。因此本专利技术涉及利用突变体花粉使得只有卵细胞受精，这将引发未受精双单倍体中央细胞的发育。在某一实施方案中，用EMS或类似EMS的化学药品诸如EES，BMS，PMS，MES，或MMS 通过化学诱变产生具有唯一一个功能性精细胞的花粉。在某一实施方案中，通过用UV光、X-射线、Y射线辐照或致电离辐射诱变产生只带一个功能性精细胞的花粉。在某一实施方案中，可用eco-tilling针对在生殖细胞中细胞分裂被抑制的适当突变筛选诱变植物。在某一实施方案中，可用eco-tilling筛选具有只含一个功能性精细胞之花粉的天然群体。在某一实施方案中，抑制生殖细胞分裂的分子在花粉发育期间瞬时表达，例如通过存在于质粒上的核酸实现。抑制分子可以是核酸或蛋白质，其通过来自质粒的组成型表达而在花粉或小孢子中产生。在某一实施方案中，所述抑制生殖细胞分裂的分子表达自稳定掺入花粉基因组的核酸。该细胞分裂抑制分子(可以是核酸或蛋白质)通过组成型表达在花粉或小孢子中产生。依照本专利技术的某一实施方案，通过用核酸转化可获得只包含一个功能性精细胞的花粉。转化可以任何适当的方式进行，诸如通过根癌土壤杆菌的方法或通过粒子轰击(基因枪)的方法。这些转化技术是众所周知的。用根癌土壤杆菌方法转化植物细胞是一项成熟技术，并且例如综述于文献 De Ia Riva et al.，EJB Vol. 1(3) (1998)，and Bent, Plant Physiol. 124 :1540-1547(2000)中。最近，人们发现植物的遗传转化不仅仅局限于土壤杆菌，其它的细菌也具有转化植物的能力(Broothaerts et al.，Nature 433，6四_633 Q005)，收编于此作为参考)。通过获取非致瘤Ti质粒(disarmed Ti plasmid)和合适的二元载体使这些植物相关的共生细菌适合于进行基因转移。这样的转化体系也适用于本专利技术。基因枪转化也是本领域技术人员众所周知的，并且用于此应用的工具多年来已是商品化了的(Ralph Bock, In =QiagenNews, Issue No. 5，1997)。用于本专利技术的合适的技术也可参阅Barinova等的文章(J Exp Bot. 53(371) 1119-29 (2002))，其中显示了在小孢子水平的DNA递送及其在金鱼草(Antirrhinum ma jus)中的瞬时表达，或者参阅Ramaiah等人关于紫花苜蓿(Medicago sativa. L.)的文章(Current Science73 :674-682 (1997))。在烟草中用基因枪轰击转化小孢子或花粉的方法可参阅BaiAak Bajoghli, (Matrikel number 9802743, University of Vienna, Experimentelle Genetic III.Plant Biotechnology by Alisher Touraev, July 2001)。文献 Van der L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·H·G·德克斯，
申请(专利权)人：瑞克斯旺种苗集团公司，
类型：发明
国别省市：