本发明专利技术提供了通过抑制非特异性扩增产物改良的基于PCR的靶序列扩增。改良涉及使用被最佳化以在第一种生物的基因组DNA的背景中扩增污染物的核酸的引物对。当对怀疑包含污染物的来自第二种生物的DNA实施相同的基于PCR的扩增反应时，当第一种生物的基因组DNA的量存在于扩增反应中时，污染物的检测灵敏度和特异性增强。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细菌(柔膜细菌)污染的改良检测本专利技术提供了通过抑制非特异性扩增产物改良的基于PCR的靶序列扩增。改良涉及使用被最佳化以在第一种生物的基因组DNA的背景中扩增污染物的核酸的引物对。当对怀疑包含污染物的来自第二种生物的DNA实施相同的基于PCR的扩增反应时，当第一种生物的基因组DNA的量存在于扩增反应中时，污染物的检测灵敏度和特异性增强。
技术介绍
支原体属(Mycoplasma)是属于缺乏细胞壁的柔膜体纲的细菌属。没有细胞壁， 支原体属细菌不受靶向原核细胞壁合成的许多常见抗生素影响，所述抗生素例如青霉素或其他β-内酰胺抗生素。存在超过100种公认的支原体属物种，柔膜体纲(Mollicutes) 中的几个属之一。柔膜细菌是人、其他动物(包括昆虫)和植物的寄生虫或共生体；支原体属通过定义被限定于脊椎动物宿主。胆固醇是支原体属以及柔膜细菌(mollicutes)的某些其他属的物种生长所需的。它们的最佳生长温度通常是其宿主的温度，如果是温血的 (warmbodied)(例如在人中37°C )，或环境温度，如果宿主不能调节其自身内部温度。16S 核糖体RNA序列的分析以及基因含量强烈暗示柔膜细菌包括支原体与系统树的乳杆菌属 (Lactobacillus)或梭菌属(Clostridium)分支(在严格意义上厚壁菌门(Firmicutes)) 紧密相关。支原体属物种通常在研究实验室中作为细胞培养中的污染物发现。支原体细胞培养污染可以由于来自个体的污染或污染的细胞培养基成分而发生。支原体细胞物理上是很小的-小于ι μ m-并且它们因此难以用常规显微镜检测。支原体可以诱导细胞改变，包括染色体畸变、代谢和细胞生长中的改变。严重支原体感染具有破坏细胞系的潜力。支原体还涉及作为许多疾病中的病原体。肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae) 是社区获得性肺炎的主要成因剂。螺原体属(Spiroplasma)物种通过分子和血清学研究近期已与传播性海绵状脑病(TSEs)关联(Bastian, F. 0. , J Neuropathol Exp Neurol 64(2005)833-838)。然而， 螺原体属物种与TSh的关系仍是有争议的，例如考虑到检测受绵羊疯痒病感染的仓鼠脑中螺原体的任何足迹的rRNA种类的参与者不知情研究的失败(Alexeeva，〗.，等人，J Clin Microbiol 44 0006)91-97)。然而，在考虑中的TSh包括绵羊中的绵羊疯痒病、鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)和人中的克雅氏病。颅内接种到绵羊和山羊内的从受绵羊疯痒病侵袭的绵羊脑和受CWD侵袭的鹿脑中分离的螺旋体属物种诱导非常类似这些动物中的天然TSE 的海绵状脑病。这些数据明确显示螺原体与TSE相关。显示螺原体属细菌在含胚卵中生长且可以在此类培养系统中传代(Bastian， F. 0.，等人，Journal of Medical Microbiology 56(2007) 1235-1242) 含胚卵在疫苗生产中起主要作用。例如，针对流行性感冒的人疫苗已可用几乎60 年，并且直到最近，几乎完全由在9到11天龄的含胚鸡卵的尿囊腔中生长的病毒进行制备。 因此，螺原体的致病性潜力使得柔膜体纲病原体的检测成为用于确保由含胚卵制备的任何产物的安全的首要重要的工具。此外，在生物药物生产、细胞疗法和组织工程过程中支原体污染的可能性尤其是主要问题。由全世界的药典和药物管理机构要求的常规检测法使用在培养基上的生长，以鉴定污染生物。这些基于培养的技术要求长时间以达到结果。此外，某些支原体属物种的培养可能是不可能或不可靠的。因此，需要改良且特别是更快速和可靠的微生物测定。Eldering, J. A.，等人，Biologicals 32 (2004) 183-193 公开了用于中国仓鼠卵巢细胞培养的支原体测试的PCR法。测试的原理是首先分离来自细胞培养(细胞和上清液) 的基因组DNA，并且其次使用对于支原体属物种的16S-rRNA基因中的区域特异的引物和分离的DNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。在阳性结果的情况下，形成且检测到对应于靶向区域的扩增产物。当未形成扩增产物时，获得阴性结果。在该方法中使用的引物是先前公开的通用支原体引物(Wong-Lee，J.G.和 Lovett, Μ. , "Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture "in !Diagnostic molecular microbiology-principles and applications ；Persing, DH, Smith, TF, Tenover, FC, White, TJ(编辑),Washington, DC, American Society for Microbiology (1993) 257J60)。Eldering，J. A.，等人(同上)的方法是测定最佳化的结果且组合了改善支原体检测的灵敏度和特异性的6个要素(1)用于与支原体基因组的扩增物比较具有不同大小的PCR产物的阳性对照质粒，(2)从怀疑被支原体细菌污染的细胞培养中分离的DNA的纯化和浓缩，(3)热启动Taq DNA聚合酶的使用，⑷其中应用从70到60°C的退火温度梯度的所谓降落PCR技术的使用，(5)PCR试剂的净化，和(6)专用设备和材料的使用。值得注意的是，关于所述最佳化PCR法的要素2，作者选择用于DNA纯化和浓缩的方法，其包括步骤(a)裂解细胞培养(细胞和培养基)，和(b)用乙醇沉淀来自裂解物的DNA 且分离沉淀的DNA。进一步公开的是此类沉淀法比使用旋转柱的用于DNA纯化的可替代方法具有优势。旋转柱一般含有具有二氧化硅表面的过滤材料。例如通过离心，通过使缓冲液经过旋转柱，使溶解于任选还含有醇的高盐和/或离液缓冲液中的DNA与过滤材料结合。在后续步骤中，DNA可以使用非离液低盐缓冲液或纯水从过滤材料中洗脱。在最佳化研究中，获得与可能存在于旋转柱中的痕量污染物一致的结果。当柱与CHO基因组DNA接触时，从旋转柱中去除痕量污染物。CHO基因组DNA的可能作用描述为用于污染物的载体的那种作用。基于Eldering，J. Α.，等人(同上)的发现和其中公开的工作流程，Roche Applied Science (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)已进一步最佳化且开发了 MYC0T00L测试试剂盒。使用测试试剂盒进行的测定提供了用于细胞和无细胞系统的高度灵敏的支原体测定。MYC0T00L特别涉及药物质量控制。先前研究涉及来自16S rRNA基因特异性引物的PCR生成的人工产物(Osborne， C. Α.，等人，FEMS Microbiology Letters 248(2005) 183-187) 得出结论使用特定引物对生成的人工产物可以通过使用用于扩增反应的不同引物来避免。本专利技术的专利技术人已发现其中MYC0T00L测定的PCR产生可以是人工产物的片段的偶然情况(参见实施例)。注意到Elder本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·比克纳，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：
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