当前发明专利技术包含生产具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括以下步骤：a)提供含有免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的亲和层析柱洗脱液，b)将亲和层析柱洗脱液与植物来源例如来自绿色咖啡豆的(α1，3)半乳糖苷酶(EC?3.2.1.22)温育，c)将温育的亲和层析柱洗脱液应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酶促抗体加工本专利技术涉及重组产生的免疫球蛋白的酶促下游加工的方法。更详细地，当前专利技术涉及在亲和层析之后，通过酶促处理改变全长的免疫球蛋白或者免疫球蛋白Fc部分的 (α ,3)糖苷键结合的半乳糖含量的方法。
技术介绍
从真核细胞得到的多肽以糖基化多肽产生。糖结构附着到氨基酸主链上作为翻译后酶促修饰。糖基转移酶被识别为大约250-300个不同的分子内的与膜结合的酶的功能家族， 其参加包括糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂类的多肽的糖结构的协同生物合成。基于它们的核苷酸单糖供体特异性将糖基转移酶分成组。例如，半乳糖基转移酶是糖基转移酶的亚类，其使用UDP-半乳糖作为激活的单糖供体，然而唾液酸转移酶使用CMP-唾液酸作为单糖供体并且岩藻糖基转移酶使用⑶P-岩藻糖作为单糖供体Ghaper，N. L.，等人，J. Mamm. Gl和Biol. Neopl. 3(1998)315-324)。对多种哺乳动物细胞上的α -半乳糖基表位的修饰是特别感兴趣的，因为人中多达的循环IgG抗体与寡糖残基相互作用。以前发现被称作“抗-Gal”的这种天然抗体与生物化学上定义的糖脂末端的1，3)(^1(β l，4)GlcNAc_R结合(Galili，U.， 等人，J. Exp. Med. 162(1985)573-582 ；Galili, U.，等人，J. Exp. Med. 165(1987)693-704)。 放射性标记的Bandeiraea(Griffonia)Simplicifolia IB4凝集素与多种具核细胞结合的测定提示与抗-Gal结合的细胞表达IO6至3. 5x IO7 α -半乳糖基表位，基于抗-Gal的特异性，大部分所述细胞看起来具有Gal (a l,3)Gal(^ 1,4) GlcNAc-R的结构。人细胞中这些表位的缺失由(α 1，3)半乳糖基转移酶降低的活性引起(Galili，U.，等人，J.Biol. Chem. 263(1988) 17755-17762)。已经证实在鼠源细胞(Cmnmings，R.D.和Mattox，S. A.，J. Biol. Chem. 263 (1988) 51 1-519 ；Blake, D.Α.，禾口 Goldstein， I. J. ， J.Biol. Chem. 256 (1981) 5387-5393 ；El ices， Μ. J. ， Blake, D. Α.，禾口 Goldstein， I. J. J. Biol. Chem. 261 (1986) 6064-6072),兔源细胞(Basu，Μ·，和 Basu，S.， J.Biol.Chem.248 (1973) 1700 — 1706 ；Betteridge， Α.，禾口 Watkins， W. Μ. ， Eur. J. Biochem. 132 (1983)四_35)、猪源细胞和牛源细胞(Blanken, W. Μ.，和 Van den Eijnden, D. H.，J. Biol. Chem. 260(1985) 12927-12934)的高尔基体中 Gal(a 1,3)表位的合成由酶 (al,3)半乳糖基转移酶催化。预期应用于人的多肽中(α 1，3)糖苷键结合的末端半乳糖残基的存在应该最少， 因为这种糖结构将引起人免疫系统的应答。这可以例如通过用于重组生产治疗多肽的细胞系的耗时开发来实现，在所述治疗多肽的糖结构中不引入(α 1，3)糖苷键结合的末端半乳糖残基。在粗制多肽的下游加工中通常使用的层析方法不能除去含有fel(al，3)的糖结构。在EP 0 255 153中报告了生产半乳糖苷酶的方法，所述半乳糖苷酶通过裂解附着在1，4连接的β-D-吡喃甘露糖基单位主链上的1，6连接的a-D-吡喃半乳糖基单位能降低半乳甘露聚糖中的半乳糖含量。在EP 0 698 793中报告了基于免疫球蛋白G连接的寡糖结构的临床检测方法。在EP 1 878 747中报告了糖工程抗体。在WO 2007/071347中报告了免疫球蛋白聚糖的选择标记。在WO 1997/016064中报告了用于减少异种移植排斥的方法和组合物。在2007/0M743中报告了具有基本上同质和未唾液酸化的糖形如GO和 G2的抗体制剂，所述抗体制剂通过酶促处理、在某些条件下表达、使用特定宿主细胞以及与血清接触来制备。在WO 2008/057634中报告了具有增强的抗炎和降低的细胞毒性性质的多肽以及相关的方法。在WO 2007/024743中报告了蛋白水解抗性的抗体制剂。专利技术概述已经发现植物来源例如来自绿色咖啡豆的(α 1，3)半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)可用于选择性地除去与(α 1，；3)糖苷键结合的末端半乳糖残基，所述末端半乳糖残基来自免疫球蛋白CH2结构域的氨基酸Asn297处的寡糖。发现非植物来源的(α 1，3)半乳糖苷酶具有(β 1，4)半乳糖苷酶的副反应性并且/或者与三个或者四个触角的寡糖反应减少或者不反应。因此，本文报告了产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的方法，其包括按照以下顺序的以下步骤-提供含有免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的亲和层析柱洗脱液，-将亲和层析柱洗脱液与酶温育，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段 CH2结构域中糖结构的末端单糖残基，-在适合免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与A蛋白层析材料结合的条件下将温育的亲和层析洗脱液应用于A蛋白层析材料并且从A蛋白层析材料中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，从而产生具有确定的糖结构的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段。在一个实施方案中，酶是植物来源的，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段的CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基。在一个实施方案中，酶选自α-D-半乳糖半乳糖水解酶(EC 3. 2. 1. 22)或者蜜二糖酶，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端的单糖残基。在另一个实施方案中，酶是来自绿色咖啡豆的(α 1，；3)半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)。在另一个实施方案中，免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的末端单糖残基是(α 1，3)糖苷键结合的半乳糖残基。在一个实施方案中，将亲和层析柱洗脱液与酶温育，所述酶裂解免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段CH2结构域中糖结构的非还原端单糖残基，所述温育包括以下步骤，-将亲和层析柱洗脱液与(α1，3)糖苷酶温育，-从温育混合物中取样品，-或者0将样品应用于A蛋白包被的琼脂糖珠，并且然后洗涤该琼脂糖珠，0从A蛋白琼脂糖珠中回收免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段，0调整用于糖苷酶/唾液酸酶消化的缓冲液条件，0将免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段与糖苷酶/唾液酸酶温育来切除全部N-聚糖，并且0在MALDI分析之前取消化物的整分试样，或者0将样品应用于A蛋白包被的磁珠，并且然后洗涤该磁珠，0将磁珠与糖苷酶温育，同时回收裂解的寡糖，并且，0用阳离子交换层析纯化裂解的寡糖，-通过质谱法确定裂解的寡糖中糖结构的非还原端的单糖残基的类型和量，-继续温育直到可被酶裂解的糖结构的非还原端的全部单糖残基被裂解。另一个实施方案包括将按照以下的顺序进行的以下步骤作为首先步骤的方法-提供包含核酸的细胞，所述核酸编码免疫球蛋白或本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·哈伯格，C·容，D·罗伊施，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：
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