本发明专利技术涉及生物制药领域，具体地，本发明专利技术涉及一种聚乙二醇-葡激酶偶联物及其制备方法和应用。所述偶联物是葡激酶N端连接有聚乙二醇共价偶联物，其中，通过聚乙二醇修饰剂将聚乙二醇共价连接到葡激酶的N端，所述的聚乙二醇修饰剂优选为单甲氧基聚乙二醇醛类修饰剂，其分子量优选为1000～40000，包括线型和分支型两种结构。本法明的聚乙二醇-葡激酶偶联物既能够大幅度的提高其体内的半衰期，同时，还能够完全保留原蛋白的生物活性，在治疗心脑血管疾病药物的制备中能够发挥巨大的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药领域，具体地，本专利技术涉及一种聚乙二醇-葡激酶偶联物及其制备方法和应用。
技术介绍
葡激酶来源于金黄色葡萄球菌，由136个氨基酸组成不含二硫键的单链，分子量约为15KD(Eur. J. Biochem. 1985,149 :557-561)。与其他溶栓剂相比，葡激酶具有良好的溶栓特异性，不引起纤维蛋白原和α-抗纤溶酶水平的降低，不易诱发全身性溶血，对富含血小板的动脉血栓具有较强的溶栓能力。由于葡激酶具有上述优良的溶纤性能，成为人们研究和开发的重点。目前葡激酶基因已经分别被克隆到hcherichia coli, Bacillus subtilis，和 Mi^ptococcus sanguis 中并实现了表达(MGG，1987，210 :528-534) 葡激酶(Mk)是一种非酶类蛋白，本身无酶活性，而是一种辅助因子，它的活化石通过与纤溶酶原结合后能使纤溶酶原(Plg)以1 1的比例结合形成复合物，但此复合物依然没有活性，而需要通过一系列的变化形成具有活化Plg的活性复合物。研究表明，在 Sak和pig形成复合物后，Sak的氨基端会去掉10个或6个氨基酸，形成低分子量Mk-plg 复合物，同时复合物上的Plg转变为纤溶酶，形成具有高度活性的复合物，进而激活更多的纤溶酶原，从而产生溶栓作用(Curr. Opin. Biotechnol,1994,5 ) :180-186)。血循环中的纤溶酶可因α-抗纤溶酶作用于赖氨酸结合位点和活性中心而迅速失活。当循环血中存在血栓凝块时，由于纤溶酶上赖氨酸结合位点和活性中心均被亲和力较高的血纤维蛋白占据，α -抗纤溶酶仅能使之缓慢失活，这时候纤溶酶就能发挥其溶栓作用。对葡激酶进行聚乙二醇(PEG)修饰可使其获得更好的物理和热稳定性、更强的抗蛋白水解和酶解能力、更好的溶解性、更低的清除率以及更好的药效等。目前国内外已经有很多相关的研究，主要是把葡激酶的一些赖氨酸位点突变为半胱氨酸，然后用修饰巯基的聚乙二醇修饰剂来修饰，或者直接用非特异性的修饰剂来修饰。这些方法修饰后得到的偶联物的最大的一个缺点是，偶联的聚乙二醇大分子阻碍了葡激酶与纤溶酶的结合，使得偶联物的生物活性相对于原蛋白有很大的下降。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术中PEG修饰葡激酶造成其生物活性降低的问题而完成的。本专利技术的目的是提供一种聚乙二醇-葡激酶偶联物，所述偶联物是葡激酶N端连接有聚乙二醇共价偶联物，其中，通过聚乙二醇修饰剂将聚乙二醇共价连接到葡激酶的N 端，所述的聚乙二醇修饰剂优选为单甲氧基聚乙二醇醛类修饰剂，其分子量优选为1000 40000，包括线型和分支型两种结构，所述的葡激酶优选为重组型的人葡激酶。本专利技术的再一目的是提供上述的聚乙二醇-葡激酶偶联物的应用。本专利技术的再一目的是提供上述聚乙二醇-葡激酶偶联物的制备方法，所述方法包括使用聚乙二醇修饰剂共价修饰葡激酶N末端的步骤，其中，所述的聚乙二醇修饰剂优选为单甲氧基聚乙二醇醛类修饰剂，其分子量优选为1000 40000，包括线型和分支型两种结构，按摩尔比，葡激酶修饰剂为1 2-10，修饰剂还原剂为1 10-50，进行反应，所述的葡激酶优选为重组型的人葡激酶。具体的本专利技术的聚乙二醇-葡激酶偶联物的制备方法包括以下步骤1)将葡激酶用10-50mM pH4_6的乙酸钠缓冲液溶解，配制成为0. 1-lOmg/mL的溶液；2)按照摩尔比，葡激酶修饰剂为1 2-10，修饰剂还原剂为1 10-50，在 40C _37°C下进行反应0. 5-24小时；3)加入IM甘氨酸终止反应；4)以Superdex 200对步骤3得到的修饰混合物进行纯化，收集聚乙二醇-葡激酶偶联物，其中，洗脱液为0. 05-0. 2mol/L磷酸缓冲液(含0. 15M NaCL)，pH6_8。本专利技术提供的聚乙二醇-葡激酶偶联物是利用特异性的PEG醛修饰剂，它能够特异性的共价修饰葡激酶的N端，由于葡激酶的溶栓作用有其特殊的作用机制，当Sak和pig 形成复合物后，Sak的氨基端去掉10个或6个氨基酸，从而才能够形成具有高活性的复合物，此时特异性连接在Sak氨基端的PEG醛修饰剂也会随之被切除掉，不会防碍此复合物进一步发挥溶栓作用，影响其生物活性。目前还没有利用PEG醛类修饰剂对葡激酶进行修饰的报道。因此，本法明的聚乙二醇-葡激酶偶联物既能够大幅度的提高其体内的半衰期，同时，还能够完全保留原蛋白的生物活性，在治疗心脑血管疾病药物的制备中能够发挥巨大的应用潜力。附图说明图1-1、图1-2、图1-3聚乙二醇-葡激酶偶联物的凝胶过滤检测谱图。图2-1、图2-2、图2-3聚乙二醇-葡激酶偶联物与纤溶酶作用后的凝胶过滤检测谱图；图3原蛋白和聚乙二醇-葡激酶偶联物的生物活性比较。 具体实施例方式实施例1、聚乙二醇O0000)-葡激酶偶联物的制备将重组人葡激酶用50mM pH5. 0的乙酸钠缓冲液溶解，配制成为lmg/mL的溶液，按葡激酶PEG醛(分子量20000)还原剂(氰基硼氢化钠)为1 4 40的摩尔比进行反应，在4°C下反应12小时，加入IM甘氨酸终止反应.用Superdex 200对得到的修饰混合物进行纯化，收集PEG-葡激酶偶联物，洗脱液为0. 05mol/L磷酸缓冲液(含0. 15M NaCL)， ρΗ7· 0。实施例2、聚乙二醇(5000)-葡激酶偶联物的制备将重组人葡激酶用50mM pH5. 0的乙酸钠缓冲液溶解，配制成为lmg/mL的溶液，按葡激酶PEG醛(分子量5000)还原剂(氰基硼氢化钠)为1 2 20的摩尔比进行反应，在4°C下反应12小时，加入IM甘氨酸终止反应.用Superdex 200对得到的修饰混合物进行纯化，收集PEG-葡激酶偶联物，洗脱液为0. 05mol/L磷酸缓冲液(含0. 15M NaCL)，ρΗ7· 0。实施例3、聚乙二醇G0000)-葡激酶偶联物的制备将重组人葡激酶用50mM pH5. 0的乙酸钠缓冲液溶解，配制成为lmg/mL的溶液，按葡激酶PEG醛(分子量40000)还原剂(氰基硼氢化钠)为1 6 60的摩尔比进行反应，在4°C下反应12小时，加入IM甘氨酸终止反应.用Superdex 200对得到的修饰混合物进行纯化，收集PEG-葡激酶偶联物，洗脱液为0. 05mol/L磷酸缓冲液(含0. 15M NaCL)， ρΗ7· 0。实施例4、聚乙二醇-葡激酶偶联物的纯度检测用 Hiload Superdex75 16/30prep grade Superdex200 16/30 prep grade 疑胶过滤预装柱在AKTA purifier蛋白纯化仪上进行偶联物纯度检测，流动相为50mM磷酸和0. IM Na2SO4, ρΗ7· 0，平衡1个柱体积以上，上样体积IOOuL,流速0. 5mL/min,紫外检测 280nm。结果如图1_1 图1_3，可见三种偶联物的纯度均大于95%实施例5、纤溶酶对聚乙二醇-葡激酶偶联物的作用首先把上述制备的三种纯化的聚乙二醇-葡激酶偶联物溶解于PBS缓冲液中，按照偶联物纤溶酶为25 1的摩尔比进行反应。在37°C下反应12小时，以Superdex 200 对反应产物进行检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏志国，马光辉，王俊，刘永东，胡涛，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。