表达方法技术

本发明专利技术提供用于制备靶多肽的表达系统。所述表达系统包括：包含与编码所述靶多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子的表达盒，和用于过表达DNA结合转录调节蛋白的表达盒，其包含与编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接的启动子。所述表达盒处于正交启动子的调控之下。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及多肽表达的方法和表达系统。学术目的或商业目的的许多多肽，特别是治疗用多肽是适宜地通过在重组宿主细胞中的表达来制备的。为了有效制备这样的异源多肽，特别是在生产环境中，优选应该调控所述多肽使得仅在生产的合适阶段制备出所述多肽。因此使多肽的表达置于诱导物的调控之下，使得需要时可通过施用合适的条件触发表达。例如诱导之前的异源多肽的表达(所谓“渗漏”表达)，即基础表达的弱调控通常是不需要的，因为一些异源多肽对宿主细胞生长和质粒稳定性具有有害作用，该作用降低总产率。在某些情况下异源多肽的渗漏表达可导致克隆期间的载体稳定性问题，致使无法构建表达所需多肽的稳定表达载体。存在大量具有不同调控和诱导模式的异源多肽表达系统，使得对用于制备目标多肽的表达系统/发酵工艺的选择和优化很大程度上是经验过程。这是耗费时间和不希望的。因此，需要提供改良的表达调控特别是改良的基础表达调控的系统。诱导型基因表达是用于基因功能分析的重要工具。对这些系统的关键要求是紧密调控基础基因表达以既降低在未经诱导的细胞中基因表达的潜在有害作用，又允许明确地辨别由于诱导基因的表达而产生的生物学相关作用。各种尝试降低或消除渗漏基础表达问题的补救办法均各有利弊。例如，降低在大肠杆菌中的基础表达的方法包括提高阻遏蛋白对操纵基因的比例、通过突变噬菌体感染的诱导、启动子强度的弱化、使用转录终止子与抗终止子的组合(由Makrides综述， Microbiological Reviews, 1996 年，第 512-538 页)。通过对抑制 T7 RNA 聚合酶的 T7 溶菌酶的共同过表达可减少PET载体(Novagen)的基础表达问题，该pET载体使用反式提供的T7 RNA聚合酶用于高水平蛋白表达。然而，用于降低或消除基础表达的最优表达成分的选择(Studier，Journal of Molecular Biology, 1991 年，第 219 卷第 1 期第 37-44 页)是经验的，需要进行筛选以测定多种载体(pLySS、pLySL、pLySE和pLysH)对基础表达和诱导性的作用。在哺乳动物细胞中使用四环素调控的表达系统的基础表达是一个问题 (Meyer-Ficca 等人，Anal. Biochem, 2004 年，334 第 9-19 页)。Lai 等人，Am. J. Physiol Cell Physiol, 2003年，285 第711-719页描述了如何使用用四环素或蜕皮激素应答元件表达的报道基因(绿色荧光蛋白)产生具有高基础表达的哺乳动物细胞。可通过使用与报道基因系统组合的荧光激活细胞分选术来除去这些细胞。Becker等人，Nucleic Acids Research, 2008,1-13公开了将真核HMGB蛋白用作大肠杆菌中的天然HU阻遏蛋白的替换。 研究了对制备天然大肠杆菌LacZ/ β -半乳糖苷酶基因的阻遏。本专利技术一方面提供了制备靶多肽的表达系统，其包括a)包含与编码所述靶多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子的表达盒；和b)用于过表达DNA结合转录调节蛋白的表达盒，其包含与编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接的启动子；其中所述表达盒处于正交启动子(orthogonal promoter)的调控之下。认识到的是，当它们被不同条件激活时启动子是正交的。这些条件可为互斥的， 或可为相容的。互斥的启动子是以下启动子，其中处于一种启动子调控之下的DNA表达所必需的条件防止处于另一种启动子的调控之下的DNA表达，包括例如四环素应答系统，其可配置为在四环素存在的情况下为“关闭的”(即防止表达)，而在缺乏“四环素”的情况下为“开启的”(即启动表达)(“四环素关闭”)，或者配置为在四环素存在的情况下为“开启的”(“四环素开启”)，而在缺乏四环素的情况下为“关闭的”。在将编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地与四环素关闭的启动子连接，和将编码靶多肽的DNA可操作地与四环素开启的启动子连接时，添加四环素将诱导所述靶多肽的表达，但防止所述DNA结合转录调节蛋白的进一步表达。在许多实施方案中，可操作地连接的DNA序列是相邻的。本专利技术的表达系统中可使用的DNA结合转录调节蛋白包括来自原核和真核生物的蛋白。原核蛋白包括大肠杆菌DNA结合蛋白HU-a/DNA结合蛋白HU-β、整合宿主因子 (IHF)-a、IHF-β和同源物。真核蛋白优选酵母(例如ΝΗΡ6Α、ΝΗΡ6Β)、或哺乳动物蛋白， 包括高丰度序列非特异性高速泳动族(HMG)蛋白。HMG蛋白分为三大家族HMGB家族(例如 HMGB-I、HMGB-2、HMGB-3) ；HMGN 家族(例如 HMGN-I、HMGN-2、HMGN_3)；和 HMGA 家族例如 HMGA-la、HMGA-lb、HMGA-lc、HMGA-2、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)) 中的线粒体组蛋白(HM)蛋白和在人类和两栖动物线粒体中发现的同源物以及原核DNA结合转录调节蛋白的真核同源物，包括编码类似于细菌组蛋白样蛋白HU的蛋白的植物(蓝隐藻(Guillardia theta))叶绿体hlpA。优选的DNA结合转录调节蛋白为大肠杆菌DNA结合蛋白HU- α /DNA结合蛋白HU- β和HMGB-1，特别地大鼠-HMGB-1。本专利技术的表达盒可整合到宿主细胞基因组中或包含于染色体外元件(例如质粒) 中。当包含于染色体外元件时所述表达盒可包含在相同的染色体外元件(例如质粒载体) 中，或包含于被共转化到宿主细胞中的相容性单独染色体外元件。或者，所述表达系统可整合到噬菌体或病毒载体中，并将它们用于将所述表达系统递送到所述宿主细胞系统中。可通过本领域已知的方法装配质粒或其它表达载体。优选本专利技术表达盒两者均以独立质粒的形式使用。所述质粒可为自主复制质粒或整合质粒。典型地所述质粒也包含以下中的一种或多种选择性标记，例如赋予抗生素抗性的序列；和cer稳定性序列。在表达盒包含于单独的染色体外元件的实施方案中，优选使用不同的选择性标记以鉴定包含两种元件的转化宿主细胞。用于所述表达盒中以过表达DNA结合转录调节蛋白的启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。本专利技术方面中可使用的组成型启动子实例包括T7Al、T7A2、T7A3、spc核糖体蛋白操纵子启动子、β-内酰胺酶基因启动子、噬菌体λ的启动子、复制调控启动子 PfflAi和PRNAII、rrnB核糖体RNA操纵子的Pl和P2启动子、Lac阻遏蛋白启动子pLacI、甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)和质膜H(+)-ATP酶(PMAl)启动子、交配因子(MF)-a启动子、KEX2、 TEF-1、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和人β-肌动蛋白启动子。更多的组成型启动子实例包括经修饰除去调控区的诱导型启动子，例如经修饰以除去Iac或tac操纵基因的Iac或tac启动子，这样的启动子在本专利技术的某些实施方案中有利，特别是当与编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接时。本专利技术方面中可使用的诱导型启动子实例包括依赖于噬菌体RNA聚合酶的启动子，特别是依赖于T7 RNA聚合酶的启动子系统，优选单一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·V·卡拉，
申请(专利权)人：富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司，
类型：发明
国别省市：