RNA合成－用于反向合成RNA的亚磷酰胺，以及在3’‑末端合成RNA的配体、发色团和修饰物的方便引入中的应用制造技术

本发明专利技术涉及新型的亚磷酰胺，制备了HPLC纯度大于98％以及

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RNA合成－用于反向合成RNA的亚磷酰胺，以及在3’-末端合成RNA的配体、发色团和修饰物的方便引入中的应用相关申请本申请要求于2008年9月6日提交的第61/191,065号美国临时申请的权益。上述申请所教导的全部内容引入本文作为参考。专利
本专利技术涉及新RNA单体亚磷酰胺的合成，以及相应的适用于RNA寡核苷酸在5’→3’反向上合成的新方法的固体载体。本方法导致非常清洁的寡核苷酸的合成，并使得能在3’-末端清洁地且有效地引入不同的修饰，从而产生高纯度治疗级的RNA寡核苷酸。专利技术背景确定序列的RNA在3’→5’方向上的合成现在是成熟的，并当前用于多种治疗级RNA适体、tRNA、siRNA和生物上有活性的RNA的合成和开发中。本方法使用具有合适的N-保护基的核苷：一般是5’-保护基，最常见的是二甲氧基三苯基，即DMT基团；2’-保护基，其中最常见的是叔丁基二甲基甲硅烷基醚；以及，3’-亚磷酰胺，其中最常见的是氰乙基二异丙基(组分1)。随后将该组分与带有适当的N-保护基的核苷，结合到固体载体上的核苷的2’或3’琥珀酸酯偶联(组分2)。在活化剂的存在下，在溶液相中也实现了组分1和5’-OH-正-保护的-2’，3’-保护的-核苷(组分3)的偶联，所述活化剂导致二聚和寡聚核苷酸的形成，随后氧化(3’→5’方向的合成)，也导致了具有3’-5’-核苷酸间连接体的保护二聚核苷的形成，Ogilvie，K.K.，Can.J.Chem.，58，2686，1980(方案1)。然而，据我们所知，尚未实现在反向(5’-3’方向)上的RNA合成。已经广泛地开发了组分1的2’-甲硅烷基醚，并且发现其具有不同寻常的稳定性。广泛地研究了甲硅烷基醚的溶剂分解作用，并已知大(bulky)的烷基甲硅烷基醚具有高度的稳定性；Bazani，B和Chvalowski，VChemistryofOrganosiliconcompounds，第1卷，AcademicPress，NewYork，1965。随后，Ogilvie及其同事关于将2’-羟基保护基用于寡核苷酸的合成完成了大量的研究工作(Ogilvie，K.K.，Sadana，K.L，Thompson，E.A.，Quilliam，M.A.，andWestmore，J.BTetrahedronLeLetters，15，2861-2864，1974；Ogilvie，K.K.，Beaucage，S.L，Entwistle，D.W.，Thompson，E.A.，Quilliam，M.A.，andWestmore，J.B.J.CarbohydrateNucleosidesNucleotides，3，197-227，1976；Ogilvie，K.K.Proceedingsofthe5thInternationalRoundTableonNucleosides，NucleotidesandTheirBiologicalApplications，Rideout，J.L.，Henry，D.W.，和BeachamL.M.，III，eds.，Academic，London，第209-256页，1983)。这些研究随后导致对于溶液相和固相的寡核苷酸合成都适用的方法，以及对具有tRNA的尺寸和性质的RNA分子的首次化学合成的持续发展(Usman，N.，Ogilvie，K.K.，Jiang，M.-Y.，andCedergren，R.J.J.Am.Chem.Soc.109，7845-7854，1987；Ogilvie，K.K.，Usman，N.，Nicoghosian，K，andCedergren，R.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5764-5768，1988；Bratty，J.，Wu，T.，Nicoghosian，K.，Ogilvie，K.K.，Perrault，J.-P.，Keith，G.andCedergren，R.，FEBSLett.269，60-64，1990)。在随后的优秀出版物中对本文献进行综述：Gait，M.J.，Pritchard，C.andSlim，G.，OligonucleotideandTheirAnalogs：APracticalApproach(Gait，M.J.，ed.)，OxfordUniversityPressOxford，England，第25-48页，1991。最近在RNA合成中采用的保护基为：双(2-乙酰氧乙基-氧)甲基(ACE)，Scaringe，S.A.，Wincott，F.E.，Caruthers，M.H.，J.Am.Chem.Soc.，120：11820-11821，1998；三异丙基甲硅烷基氧甲基(TOM)Pitsch，S.，Weiss，P.A.，Jenny，L.，Stutz，A.，Wu，X.，Helv.Chim.Acta.84，3773-3795，2001以及叔丁基二硫代甲基(DTM)(结构1)，Semenyuk，A.，Foldesi，A.，Johansson，T.，Estmer-Nilsson，C.，Blomgren，P.，Brannvall，M.，Kirsebom，L.A.，Kwiatkowski，M.，J.Am.Chem.Soc.，128：12356-12357，2006，以上都已被引入。然而，这些方法中没有一个可以从反向(5’→3’方向)进行RNA的合成；因此它们缺少在RNA分子的3’-末端方便且充分地引入多种配体和发色团的能力，这些通过反向合成都可以实现。为了体现siRNA的活性，将阿拉伯糖、2’-脱氧-2’-氟-β-D_阿拉伯糖核酸(FANA；结构2))和2’-脱氧-4’-硫-2’-氟-β-D_阿拉伯糖核酸(4’-硫-FANA；结构3)修饰进序列中来合成化学修饰的RNA，Dowler，T.，Bergeron，D.，Tedeschi，Anna-Lisa，Paquet，L.，Ferrari，N.，Damha，M.J.，Nucl.AcidsRes.，34，1669-1675，2006。在几种已经开发了其化学性质的新的2’-保护基中，2’-保护的-2-氰乙氧基甲基(CEM)(结构4)显示出用于制备非常长的RNA，然而其也是以传统的即3’→5’方向进行RNA合成。并且，通过这些方法产生的RNA的质量仍待考察。期待进行RNA的化学合成，因为其避免了如T7RNA聚合酶体外转录进行之类的合成在规模上的不足和限制，Helm，M.，Brule，H.，Giege，R.，Florence，C.，RNA，5：618-621，1999。RNA的化学合成对于RNA结构和功能的研究而言是期待的，并且可以选择性地实现多种有用的修饰，如位点特异性地引入官能团；即二硫化物的交联作为RNA三级结构的探针，Maglott，E.J.，Glick，G.D.，Nucl.AcidsRes.，26：1301-1308，1999。长的RNA的合成对于如tRNA之类的生物活性分子而言是非常重要的，并且这样的合成已经实现了；Persson，T.，Kutzke，U.，Busch，S.，Held，R.，Harmann，R.K.，Bioorgan.Med.Chem.，9：51-56，200本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2008.09.06 US 61/1910651.一种式(1)的亚磷酰胺，其中，Y为氧或硫；W为氧；R4选自叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧亚甲基、芴基甲基氧羰基(Fmoc)、烷基、芳基和乙酰基；Z为由二甲氧基三苯基(DMT)、一甲氧基三苯基(MMT)和三甲氧基三苯基(TMT)组成的保护基；R1为烷基或芳基；R2为烷基或芳基；R3为氰乙基，烷基或芳基；并且B选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·C·斯里瓦斯塔瓦，S·P·巴杰帕伊，N·P·斯里瓦斯塔瓦，D·潘迪，
申请(专利权)人：坎姆根公司，
类型：发明
国别省市：