本发明专利技术提供了一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，属于农业生物技术领域。以单粒稻米研磨棒砸碎后，经苯酚-氯仿-异戊醇和氯仿-异戊醇两步抽提后，用醋酸钾和异丙醇共同沉淀核酸；DNA沉淀经70%乙醇润洗后室温干燥，加入去离子水溶解，得到DNA粗提液；向粗提液中加入RNA核糖核酸酶A，处理后重复氯仿-异戊醇抽提、核酸沉淀、润洗、干燥、溶解等步骤，获得较高质量的DNA溶液。采用本发明专利技术方法能有效的从单粒稻米胚乳中提取高质量的水稻基因组DNA，这些DNA不仅能有效用于稻米品种真实性和纯度的分子鉴定，解决其真伪判别的关键性技术难题；同时，还可用于水稻大片段基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业生物
，涉及一种稻米DNA的提取方法，尤其涉及一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法。
技术介绍
随着我国国民经济的发展以及人民生活质量的提高，稻米市场开始出现由“量”到 “质”的转变，优质稻米特别是优良食味稻米倍受广大消费者青睐。以日本优质大米“越光”和“一见钟情”为例，其价格为普通大米的数倍，但市场仍供不应求(巩迎军等，中国农学通报，2008J4 (12) :96-101)。因此，实现优质稻米的产业化不仅能有效提升我国稻米的市场竞争力，同时也是促进农业增效、农民增收的重要途径(曾松亭，杂交水稻，2010，Sl 550-552)。优良水稻品种的培育和优质稻米品种品牌的创制是实现优质稻米产业化的前提和关键(刘与忠，中国粮食经济，2010，12:24-25)。然而，这些还不足以解决优质稻米产业化发展过程中出现的许多问题。近年来，由于受经济利益的驱使，优质稻米品牌的假冒事件层出不穷，利用伪劣的稻米品种进行掺假，不仅给优质稻米的品牌形象造成极大的负面影响， 同时也给稻米加工企业以及消费者带来严重的利益损失。以黑龙江著名的优良食味稻米品牌“五常大米”为例，其加工品种主要是“五优稻一号”、“五稻三号”、“富士光”以及“稻花香二号”，而市场上销售假“假米”往往是一些收购的散装大米。由于长期缺乏必要的稻米真实性和纯度检测技术，其品牌质量得不到保证，致使五常优质稻米的产业化发展陷入困境(英犁等，绿色中国，2010，14 50-52 ；杨立坚，科协论坛，2011，1 :152)。因此，如何实现市售稻米品种真实性和纯度的快速鉴定开始成为科研单位、质量监督部门、稻米加工企业以及消费者等多方密切关注的问题。目前，稻米品种真实性和纯度鉴定的方法虽然较多，如碾米品质法、外观观察法、 蒸煮食味法、蛋白质分析法等，但这些方法的适用范围狭窄，可靠性不高，鉴定效果也并不理想。随着分子生物学的发展，基于DNA变异的分子标记开始被广泛应用于不同植物品种的真实性和纯度鉴定，由于该方法直接以DNA的形式出现，其差异体现的是不同品系的基因型差异，因而较其它物理、化学方法更为简单、准确(金伟栋等，上海农业学报，2006，22 (1) :104-108)。因此，利用分子标记技术来进行稻米品种真实性和纯度鉴定是目前最佳的技术方案。高质量基因组DNA的提取是实现稻米品种分子鉴定的基础。目前关于从水稻叶片、茎秆、幼穗、干种子等组织器官中提取基因组DNA的方法国内外报道的很多 (Dellaporta SL et al. , Plant Mol. Biol. Rep. , 1983，1 (1): 19-21;田洁等,应用与环境生物学报，2004，10 (2) :143-145 ；赵红霞等，湖北大学学报(自然科学版)，2006， 28 (4) :389-392 ；韩美丽等，江西农业学报，2009，21 (5) :1_3)。然而，这些方法均不适合进行稻米品种真实性、纯度的分子鉴定。这是由于市场上销售的精加工稻米仅含有胚乳组织，而胚乳中存在大量阻碍DNA提取的次生物质如淀粉、蛋白质、多糖、酚类杂质等，因此与水稻其它部位相比，稻米胚乳DNA的提取，特别是单粒稻米胚乳DNA提取，还存在着一定的难度(郑霏琴等，植物生理学通讯，1993，四(6) 438-440 ；沈文彪等，遗传，2003，25 (2) 208-210)。因此，建立一种能从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，不仅能有效用于稻米品种真实性和纯度的分子鉴定，解决其真伪判别的关键性技术难题；同时，还可用于水稻大片段基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。
技术实现思路
技术问题本专利技术涉及一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法。针对稻米胚乳富含淀粉、蛋白质、多糖、酚类杂质等特点，采用特殊的提取步骤(如去除多糖、充分裂解细胞、降解蛋白等)，从单粒稻米胚乳中获得浓度、纯度较高的基因组DNA。这些DNA不仅能有效用于稻米品种真实性和纯度的分子鉴定，同时还可用于水稻大片段基因的特异扩+曰O技术方案本专利技术的内容是一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤1)去除稻壳、种皮、果皮、胚的单粒稻米，经牛皮纸包裹后，用研磨棒砸碎装入1. 5 mL离心管；1)2)加入800 μ L洗涤液于摇床上低速(120 rpm)振荡5 min去除多糖，4，000 rpm离心2 min后，丢弃上清液收集沉淀，其中洗涤液成分包括100mM pH=8. 0的"Tris-HClJOmM EDTA，0. 35M山梨醇Sorbitol，质量比为1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP-40 ；2)3)在沉淀中加入添加了蛋白酶K和表面活性剂NP-40、Tween-20等试剂的600 μ L DNA提取缓冲液，漩涡振荡使沉淀悬浮并上下颠倒混勻，而后置于65° C水浴45min以裂解细胞，其中DNA提取缓冲液成分包括质量比2%CTAB，IOOmM Tris-HCl, 25mM EDTA, 15M NaCl，质量比 l%PVP-40,0. lmg/mL 蛋白酶 K，质量比 0. 5%NP_40，质量比 0. 5% Tween-20，其中蛋白酶K、表面活性剂NP-40和Tween-20现用现加；3)4)待上述混合物冷至室温后加入600 μ L苯酚氯仿异戊醇体积比为25 24 1的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，于摇床上低速(120 rpm)5-10 min振荡至乳白色，12，000 rpm 离心5 min，定量吸取500 μ L上清液至另一新离心管，再加入500 yL氯仿异戊醇体积比为M :1的氯仿-异戊醇混合液，于摇床上低速(120 rpm)振荡至乳白色5_10 min, 12，000 rpm离心5 min后，定量吸取400 μ L上清液至另一新离心管，加入40 μ L ρΗ=5. 2的5 M 醋酸钾溶液和四3 PL的异丙醇混勻，于4° C放置2h，12，000 rpm离心10 min，丢弃上清液，收集DNA沉淀，加入1 mL体积比为70%乙醇后轻弹管底使沉淀悬浮，于摇床上低速(120 rpm)振荡2 min, 7, 000 rpm离心3 min，丢弃上清液，室温下干燥沉淀，加入100 μ L去离子水溶解沉淀，获得DNA粗提液；5)向粗提液中加入核糖核酸酶A至终浓度0. 1 mg/mL,37° C温浴30 min去除RNA，再加入氯仿异戊醇体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液抽提并重复上述的沉淀、润洗、干燥、溶解等步骤后，将沉淀用100 μ L去离子水溶解，即获得DNA溶液。有益效果本专利技术提供的一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，与现有水稻基因组DNA提取方法相比，具有以下优点1)本专利技术提供的一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，其提取的主要对象为单粒稻米胚乳。由于稻米胚乳组织具有淀粉、蛋白质、多糖、酚类杂质等较多的特点， 采用现有DNA提取方法很难从单粒稻米胚乳中获得质量较好的基因组DNA。而本专利技术在DNA 提取过程中采取特殊的实验步骤，能有效去除多糖、充分裂解细胞、降解蛋白，从而获得浓度、纯度较高的基因组DNA;2)利用本专利技术提供的方法从单粒稻米胚乳中提取高质量本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵庆勇，姚姝，陈涛，赵春芳，周丽慧，于新，张亚东，朱镇，赵凌，王才林，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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