本发明专利技术涉及一种新的芽孢杆菌，分类命名是短小芽孢杆菌(Bacillus?pumilus)BY-1。该短小芽孢杆菌从藏猪新鲜粪便中分离，能产生纤维素酶，具有降解羧甲基纤维素钠的能力，在37℃，220rpm培养96h后羧甲基纤维素酶活性为0.92μmol/ml·min。以Bacillus?pumilusSAFR-032内切酶基因bglC基因序列为参考，设计引物成功扩增出了短小芽孢杆菌(Bacillus?pumilus)BY-1的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因，命名为bglC-BY。经NCBI?blast该基因与bglC相似度为88％，而与Bacillus?pumilus?endoglucanase?A?precursor(EglA)基因相似性较高为96％，实现了pET表达系统表达并在培养温度为30℃，220rpm情况下，在菌液吸光值A595为0.7534时开始诱导，诱导后42h小时活性最高，胞外酶活测定最高为0.5434μmol/ml·min。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种菌株，特别是一种从藏猪粪便微生物有益菌群中分离的芽孢杆菌，该芽孢杆菌是一种新的短小芽孢杆菌，分类命名是芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-l, 可用于纤维素酶的提取及应用，或者作为防治消化道疾病的药品或药用添加剂的应用等。
技术介绍
1、纤维素酶应用领域和前景纤维素酶广泛应用于畜牧业、纺织业、造纸业、饲料业、食品工业等各个领域，并在新型能源转化中起到举足轻重的作用。近年来，人民生活水平的提高促进了畜牧生产由传统的农户散养向集约化、现代化生产转变，与之而来的是动物饲料的短缺。因此在饲料原料短缺的情况下，农作物秸秆在动物饲料的应用逐渐得到了人们的重视。在畜牧业和饲料工业中，纤维素酶应用广泛。反刍动物饲养中，纤维素酶的主要应用是作为一种外源饲料添加剂，以促进粗纤维的分解和营养物质的利用进而提高粗纤维的消化率和缓解能量饲料的紧缺现状。此外研究表明，外源添加纤维素酶可以减少牲畜粪便营养物质损失，提高幼小牲畜的日增重，提高乳产量和乳品质等；在单胃动物中，纤维素酶的外源添加可以有效减少粪便和尿液中氨态氮的损失，因此可以减小臭气的来源，大大改善养殖场饲养环境，提高动物福利；在禽类养殖中，外源纤维素酶的添加可以有效提高日粮能量水平，蛋白利用率和日粮成分消化率以及饲料报酬，在养禽业中应用价值较高。尤其是本专利技术在草食单胃动物-藏猪中发现这种可充分解和消化粗纤维的菌株，对于发展节粮养殖业意义十分重大。此外纤维素酶还可应用于生物乙醇生产，即将粗纤维分解为单糖，进而通过生物发酵产生酒精并进行提纯，生产新型清洁能源。生产和使用生物乙醇可以减少燃油消耗和温室气体的排放。在造纸业和食品工业中，都具有很广泛的用途。2、粗纤维降解菌应用领域及前景秸秆等混合料中加入微生物制剂进行堆积发酵，纤维降解产物为微生物生长提供糖类，有益微生物迅速繁殖，快速分解粪便和秸秆中有机质，产生生物热能，堆料温度可升至60°C 70°C，抑制或杀死病菌、虫卵等有害生物，在矿质化和腐殖质化过程中，释放出氮磷钾和微量元素等有效养分，吸收、分解恶臭和有害物质。畜禽粪便经过生物发酵腐熟后， 经热风旋转烘干处理，便成为无害、无臭、无病菌和虫卵的优质有机肥，并能改善动物养殖环境。其次，由于抗生素的大量使用，造成微生物的耐药性、毒性、致畸性、致癌性、突变性等弊端的逐渐暴露，残毒、对环境的破坏、对人类健康的威胁已成为突出问题，禁用抗生素的呼声越来越高。寻找绿色环保型抗生素替代物，减轻抗生素对畜禽生产带来的负面影响成为各国畜牧业迫切需要解决的问题。在这种背景下，微生物制剂成为一个研究热点问题。目前，微生态制剂的菌种主要有芽孢杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌等传统菌种。芽5孢杆菌属在消化道内可以迅速发育、增长，具有很好的助消化、促生长作用并能产生少量抗菌物质-菌杆肽对有害微生物起抑制和杀灭的作用，其单属制剂常为助消化促进生长添加剂，也可作为防治消化道疾病的药品或药用添加剂使用，适合猪、牛、鸡等家畜、禽以及水产动物。纤维分解菌作为微生态添加中的重要组成成分，能够与添加剂中的其他菌形成稳定的微生态环境，其分解纤维素所产生的糖类可作为其他菌的生长所需营养，有效地提高了饲料的利用率，特别是粗饲料的消化率。无论微生物作为何种生产用途，理想的微生物菌种应该是不会使人和动物致病， 不与病原微生物产生杂种；在体内外易于繁殖，体外繁殖速度快；经加工后活菌存活率高， 稳定性好；最好来自动物自身肠道中。因此筛选天然存在的微生物用于解决目前生产中的难题至关重要。
技术实现思路
本专利技术目的在于，提供一种新的芽孢杆菌，其分类命名是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-I (以下简称BY-1)，具有较高的纤维素酶活性，可用于养殖场粪便纤维降解， 改善养殖场动物生存环境，用于微生物制剂，以防治动物肠道疾病的发生。本专利技术的另一目的是提供上述BY-I的16SrRNA基因片段序列及一个新的内切纤维素酶基因序列bglC-BY。克隆的纤维素内切酶基因经过外源表达后仍然具有较高的纤维素酶活性。BY-I是以陕西周至县添鑫藏香猪养殖场散放饲养的藏猪新鲜粪便为材料，经分离、筛选获得，与现有技术相比，具有以下优点1)该菌株是从藏猪新鲜粪便中筛选出的纯天然菌种，其发酵上清液具有很高的纤维素酶活性，该纤维素酶最适宜反应温度和PH值分别为55°C和7. 21，在pH 5. 17-9. 08之间可以保持50%，在70°C时可保持70%以上的活性。具有较广的pH和温度耐受性。可以直接用于粪肥腐熟处理、纤维素酶提取、粗纤维降解等。2)克隆到的bglC-BY基因经pET系统表达后具有明显的酶活性，上清液可用于纤维素酶的开发与研究。附图说明图1是BY-I菌体革兰氏染色；图2是BY-I孢子观察；图3是依16SrDNA序列构建的短小芽孢杆菌BY菌株的系统进化树图；图4是bglC-BY基因的克隆电泳图；图中的标记表示M，Marker III ；1_8，扩增产物带；图5是菌落PCR检测电泳图；图中的标记表示:M, Marker III ；1_8，扩增产物条带；图6是依bglC-BY基因构建的短小芽孢杆菌内切纤维素酶基因序列进化树；图7是葡萄糖浓度曲线；图8是培养时间对菌体生长以及产酶的影响曲线；图9酶的最适pH值曲线；6图10酶反应的最适温度曲线；图11是bglC-BY基因编码氨基酸种类及数量分析；图12是bglC-BY基因结构域预测图及注解；图13是bglCBY蛋白四级结构预测图；图14是含重组质粒bglC-pET细菌的生长曲线以及上清液酶活曲线；图15是SDS-PAGE检测分泌蛋白。以下结合附图和具体试验及对本专利技术作进一步的详细说明。 具体实施例方式本专利技术的芽孢杆菌，分类命名是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BY-l，申请人于2011年9月23日送中国典型微生物保藏中心保藏，经检测结果为存活，在中国典型微生物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2011329。该短小芽孢杆菌从藏猪新鲜粪便中分离，能产生纤维素酶，具有降解羧甲基纤维素钠的能力，在37°C，220rpm培养条件下，pH值7. 21和55°C测定条件下，羧甲基纤维素酶活性为 0. 92ymol/ml · min。申请人:以Bacillus pumilus SAFR-032内切酶基因bglC基因序列为参考，设计引物成功扩增出了 Bacillus pumilus BY-I纤维素内切酶基因bglC-BY。经NCBI blast比对， 该基因与bglC相似度为 88%,而与Bacillus pumilus endoglucanase A precursor (EglA) 基因相似性较高为96%，说明bglC-BY与已经公布的短小芽孢杆菌纤维素内切酶基因有相似性，但是却不相同。克隆出的基因bglC-BY实现了 pET表达系统表达并在培养温度为 30°C，220rpm情况下，在菌液吸光值A595为0. 7534时开始诱导，诱导后4 小时活性最高， 胞外酶活测定最高为0. 5434ymol/ml · min。该短小芽孢杆菌BY-I菌株在纤维素酶提取、粗纤维降解、研发微生物制剂，特别是在选育草食猪，以及大力发展节粮性养殖业方面具有重要意义和广本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹斌云，刘海艳，杨明明，肖文萍，安小鹏，王建刚，宋宇轩，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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