本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一株针对鸭疫里默氏杆菌的单抗及其应用。所说的单抗5G7，其保藏编号为CGMCCNo.5165。本发明专利技术还公开了该单抗在制备检测鸭疫里默氏杆菌的免疫胶体金试纸中的应用。使用本发明专利技术的金免胶体疫试纸不但可以直接检测病原，而且可同时检测血清型1、2、3、11型RA菌株，具有较为广泛的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及抗体工程技术，具体为识别不同血清型鸭疫里默氏杆菌的单克隆抗体及其以此为基础建立的一种免疫胶体金方法来检测鸭疫里默氏杆菌。
技术介绍
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)是引起鸭传染性浆膜炎的病原菌，它主要侵害以水禽为主的多种家禽而引起急性或慢性传染病。发病病鸭常表现出嗜睡、 歪颈、跛行、排黄绿稀粪，眼鼻有浆液性分泌物，随后出现痉挛、角弓反张等神经症状。以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎为其病变特征。目前在我国已先后报道了血清1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14型和4个未定名型，其中以血清1型和血清2 型为主要流行型。世界各养鸭地区几乎都有该病流行，已成为危害养鸭业最严重的疾病之一，该病病死率高，又可引起鸭生产性能降低，且治疗费用较高，造成的经济损失巨大。因此如何准确、快速的诊断成为防治该病的关键。针对RA的检测方法目前主要有细菌分离鉴定、凝集试验、琼扩试验、间接ELISA 试验、PCR检测和免疫胶体金试纸条等，其中以ELISA、免疫胶体金试纸条和PCR方法较为快速准确。免疫胶体金试纸是20世纪90年代新兴的一种快速诊断技术，是单克隆抗体技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。该技术产品检测原理有双抗体夹心法和竞争法两种，在临床医学和兽医学领域广泛应用。在人医领域，李新富等(1988)首次建立固相金银染色法检测血清中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。陈根路(1989)利用IGSS检测病人血清中的抗结核抗体，同年王明海以IGSS检测了淋巴组织中的HIV抗原。皮国华等 (1995)建立了检测血清中丙型肝炎病毒抗体的胶体金免疫吸附试验(GCISA)，1996年又建立了检测HBsAg的GCISA方法。兽医应用方面，张改平(2001)制了检测法氏囊病毒的快速诊断试剂条，现已有商品出售。黄印尧等(2002)研制了检测猪瘟抗体的免疫金标试纸条，与 Dot-ELISA和间接血凝法的符合率达100%。王中力等标记纯化的犬细小病毒单克隆抗体， 制成诊断CPV抗原的快速诊断试纸条，在临床应用中取得了较好的效果。但目前已建立的用于RA检测的胶体金试剂条只有辜新贵(2008)等使用重组表达蛋白作为诊断抗原建立双抗原夹心法研制胶体金试纸条，可以检测RA1、2、5、8、10不同血清型的抗体，可应用于诊断和免疫检测。但针对抗原检测的胶体金试纸条方法还没有，有必要开展相关研究，以满足现场和生产实践中的需求，对该病的诊断可提供快速有效的工具。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了 1株针对鸭疫里默氏杆菌的单抗，以及该单抗的应用，有效地解决了现有技术存在的问题。本专利技术所述的鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体细胞株，命名为5G7，其保藏编号为 CGMCC N 0.5165。该单抗具有良好的特异性，与鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌无交叉3反应，与已知血清型1、2、3、11型RA菌株反应，Western-blot结果显示单抗5G7可结合 45KD左右蛋白条带；采用低温高速离心法纯化胶体金抗体，确定金标记抗体、抗原及二抗稀释度，组装成免疫胶体金试纸检测鸭疫里默氏杆菌。本专利技术还公开了所述单抗5G7在制备检测鸭疫里默氏杆菌的免疫胶体金试纸中的应用。使用本专利技术的金免胶体疫试纸不但可以直接检测病原，而且可同时检测血清型1、 2、3、11型RA菌株，包含了其主要流行血清型菌株，具有较为广泛的应用价值。为鸭传染性浆膜炎的诊断提供了快速、特异、敏感的检测方法。附图说明图 1 是 RA 全菌 SDS-PAGE 电泳图。M: Marker 图2是单抗5G7ffestern-blot分析。图3是RA胶体金方法的特异性试验结果，其中1:大肠杆菌；2:沙门氏菌；3:巴氏杆菌 4-7:11、3、2、1 型 RA。图4是RA菌液胶体金检测的敏感性试验结果，其中1: 109CFU/mL; 2: 108CFU/ mL; 3:107CFU/mL; 4: 106CFU/mL; 5:105CFU/mL。图5是RA模拟病料胶体金检测的敏感性试验结果，其中1: 104 CFU /mL; 2: 105 CFU /mL; 3:106 CFU /mL; 4: 107 CFU /mL;5: 108CFU /mL。具体实施例方式本专利技术中生物材料可通过以下途径获得1、2、3、11四个血清型的RA:参考文献1、3型言天久.百色市鸭疫里默氏杆菌病流行病学调查与防治的研究.广西大学，2007。2型与11型杨勇.江苏部分地区鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及致病性研究，扬州大学，专业硕士论文，2008。云水丽，杨勇，王小波等.11型鸭疫里默氏杆菌分离鉴定及致病性研究.预防兽医学报，2009，8:605-609。巴氏杆菌(国内标准强毒菌株C48-1，购自中国兽医药品监察所)。沙门氏菌(鸡肠炎沙门氏菌参考株C500041，购自美国ATCC)。大肠杆菌(DH5 α，购自Promega公司)。1、单抗的制备 1. 1抗原的制备复苏血清1型和2型鸭疫里默氏杆菌，经传代后全板划线，扩大培养。收获并进行细菌计数，0. 1%甲醛灭活后最终将细菌稀释至109CFU/mL。1.2动物免疫分别取血清1型和2型适量的菌液(100 μ L左右)与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化， 皮下分点注射8周龄BALB/c小鼠200 μ L/只；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。1. 3 融合取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈脱白将小鼠致死，无菌取脾脏，分离脾细胞，经台盼蓝计数，按5:1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞(2X IO7)混合，在PEG4000作用下进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用HAT选择培养基重悬，置37°C 5% CO2 培养箱内培养；5d后半量换液；IOd后改用HT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取100 μ 1细胞上清进行抗体检测。1.4杂交瘤细胞的筛选分别以血清1型和血清2型全菌为检测抗原，采用间接ELISA方法来筛选阳性克隆。将全菌用PBS稀释，108CFU/mL, 100 μ L/孔包被酶标板，50°C烘箱过夜烘干；每孔加入冷甲醇固定，100 μ L/孔，15min ；用PBST洗涤3遍，每次5min,在吸水纸上拍干；加封闭液200 μ L/ 孔，4°C反应过夜，同上洗涤3遍；加入待检细胞上清IOOyL/孔，37°C孵育lh，同上洗涤3 遍；加入工作浓度(1 :8000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG 50 μ Li/孔，37°C孵育lh，同上洗涤3 遍；加入TMB显色液50 μ L/孔，37°C反应10_15min ；加入2M H2SO4 50 μ 1/孔终止反应。测定孔内的0D45(i。免疫小鼠血清作为筛选时的阳性对照，非免疫的ICR小鼠血清作为阴性对照，同时设立空白调零孔。1. 5杂交瘤细胞的亚克隆采用有限稀释法对ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞进行亚克隆。将阳性孔中的杂交瘤细胞吹下，经计数后用HT培养基稀释，按1个细胞/孔、3个细胞/孔、10个细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：彭大新，高以明，陈素娟，陈冰，孙化露，张敬友，刘秀梵，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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