本发明专利技术公开了一种提取河蟹DNA的方法，其步骤包括：(1)绒毛剪取：剪取中华绒螯蟹螯足(蟹钳)上的绒毛少许，去离子水清洗两遍；(2)绒毛DNA提取：配制裂解缓冲液后，进行绒毛消化，离心，加饱和NaCl溶液和氯仿，离心，加异丙醇，离心沉淀DNA，洗涤，离心后烘干，加去离子水或TE溶液保存DNA。本发明专利技术方法可简便、快速、有效的提取河蟹绒毛DNA，提取的DNA质量高，不受蛋白质的污染，提取的绒毛DNA可用于分子生物学分析，从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具有重大科学意义和实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及河蟹绒毛DNA的提取方法，具体地，涉及一种快速、方便、无损伤生物体的提取高质量DNA的方法。
技术介绍
河蟹包括中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)、日本绒螯蟹(Eriocheir japonica) 和合浦绒螯蟹(Eriocheir hepuensis)等，它们均隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustaceae)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)，绒螯蟹属(Eriocheir)。中华绒螯蟹是我国重要的经济甲壳动物和水产养殖对象，在我国自然分布广泛，但主要分布于长江、辽河以及瓯江流域。自20世纪80年代后期，河蟹的人工养殖和苗种培育迅猛发展， 出现了中华绒鳌蟹盲目的人工移殖，已造成各水系绒鳌蟹种质资源混杂和性状衰退。鉴于此，为保证中华绒螯蟹宝贵物种资源的可持续利用，必须加强对其遗传资源的研究，分析其遗传多样性。然而，进行河蟹的遗传研究以及种质资源的提纯和复壮，需要对大量的河蟹样本进行分子生物学分析，而进行分子生物学分析工作的基础是获得良好的DNA以及RNA等样本。传统的河蟹DNA提取往往利用河蟹的肌肉进行细胞裂解消化，然后提取DNA，这种提取 DNA的方法对河蟹具有很严重的损伤，往往会影响一些优质河蟹的后期育种工作，由于缺少了部分的步足，会导致河蟹的抱卵率低、成活率低、甚至死亡的现象，严重制约了河蟹的人工育苗技术，进而影响了河蟹的遗传改良工作。由此可见，开展河蟹无损伤的DNA提取方法十分重要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是通过设计河蟹绒毛细胞的裂解缓冲液和饱和 NaCL法提取河蟹基因组DNA，提供一种简便、快速、高效的提取河蟹绒毛DNA的方法，提取河蟹绒毛DNA质量高，可用于种质研究与遗传分析，既保障河蟹活体的无损伤，又满足了实验 DNA样本的需求。本专利技术提供的技术方案是一种提取河蟹DNA的方法，包括如下步骤(1)剪取河蟹绒毛；(2)提取河蟹绒毛DNA，步骤如下a.将第(1)步剪取的河蟹绒毛加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化，其中裂解缓冲液的成分与浓度为:0. 05M EDTA,2% SDS,0. OlM Tris-Cl,0. 3M 乙酸钠，10mg/ml DTT ；b.将步骤a得到的消化液离心，取上清液加饱和NaCl溶液和氯仿，混勻；C.离心，取上清液加入异丙醇；d.离心沉淀DNA;e.洗涤DNA，轻摇混勻；f.离心，将沉淀DNA烘干； g.在烘干后的DNA加去离子水或TE溶液，并加入RNA酶去除DNA中的RNA，保存所述的提取河蟹绒毛DNA的方法，第(1)步中，剪取河蟹螯足上的绒毛少许，剪取过程中尽量取靠近基部毛囊部的绒毛。所述的提取河蟹绒毛DNA的方法，步骤a中，优选地，河蟹绒毛的根数与加裂解缓冲液和蛋白酶K的量之间的关系是河蟹绒毛15-20根，加500ml裂解缓冲液和浓度为 20mg/ml的蛋白酶K 20 μ L，于56°C的的烘箱中过夜消化，至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止。本专利技术具有如下优点本专利技术方法是本专利技术人近几年在对中国各水系河蟹DNA提取的不断摸索过程中， 选择河蟹绒毛作为提取DNA的材料，通过设计河蟹绒毛细胞的裂解缓冲液，利用河蟹鳌足上的绒毛通过饱和NaCL法提取河蟹基因组DNA可以满足不伤害河蟹自身，又能获得良好的 DNA的要求，不仅在科学技术上，而且在河蟹种质资源保护与利用上均具有十分重要的意义和价值，而且对其它甲壳动物的DNA提取也具有借鉴作用。本专利技术方法可简便、快速、有效的提取河蟹绒毛DNA，提取的DNA质量高，不受蛋白质的污染，提取的绒毛DNA可用于分子生物学分析，从而为河蟹的遗传多样性研究、种质保护和资源利用提供一项技术手段，具有重大科学意义和实用价值。附图说明图1为本专利技术提取DNA的电泳直接检测结果；图2为本专利技术提取DNA的微卫星引物PCR扩增检测结果。具体实施例方式一、绒毛采取1.剪取河蟹螯足(蟹钳)上的绒毛少许，剪取过程中尽量取靠近基部毛囊部的绒毛。2.剪取的绒毛用去离子水清洗两遍，去除绒毛上的灰土等杂质，洗净后的绒毛用于DNA直接提取，或保存于95%的酒精中备以后提取DNA。二、绒毛DNA提取1.裂解缓冲液配制用去离子水配制的裂解缓冲液的成分与浓度为0. 05MEDTA， 2% SDS,0. OlM Tris-Cl，0. 3M 乙酸钠，10mg/ml DTT。2.消化取绒毛少许(15-20根左右)剪碎覆盖住1. 5ml离心管底部，向离心管中加入500ml裂解缓冲液和20 μ L蛋白酶K(20mg/ml)，于56°C的的烘箱中过夜消化(14-15 小时)，至澄清的裂解缓冲液转变为混浊呈橙黄色为止。若绒毛难消化可视情况酌量增加消化时间，但不需要绒毛全部消化。3.离心将上述离心管于离心机中4000rpm，aiiin离心后，将上清液转入另一干净的离心管中。4.加饱和NaCl溶液向离心管中加350 μ L饱和NaCl溶液，缓慢摇动lOmin，充分混合均勻；5.加入氯仿往离心管中加于氯仿400 μ L，轻轻摇动混勻IOmin ；6.离心将离心管放入离心机内，室温12000rpm，离心20min，将上清液移入另一干净的离心管中。若离心后上下两层页面间杂质较多，可重复(3)、(4)步骤1-2次。7.加异丙醇向离心管中加入450 μ L预冷(_20°C预冷)的异丙醇；8.离心沉淀DNA :4°C 13000rpm,离心20min，倒掉上清液，沉淀DNA ；9.洗涤向离心管中加入800 UL 75% (_20°C预冷)的酒精洗涤DNA，轻摇混勻；10.离心4°C 13000rpm,离心 15min 沉淀 DNA ；11.烘干倒掉酒精，于37°C烘箱中烘干，使酒精挥发；12. DNA溶解保存于烘干后的DNA加去离子水或TE溶液50 μ L，并加入RNA酶 0. 5yL去除DNA中的RNA。三、DNA检测(一 )紫外分光光度计检测取DNA溶液2ul，加入98ul去离子水稀释50倍后，用752型紫外分光光度计检测样品在OD值为沈0、观0时的吸光光度值。DNA的纯度根据OD26tZOD28tl的比值确定。高质量的DNA溶液的OD260/OD280比值1. 8-2. 1之间。比值为2. 0是高质量DNA的标志，说明DNA溶液未受到蛋白质的污染。上述主要检测DNA纯度，其扩增效果和使用效率情况还需作进一步检测，如电泳检测、PCR检测。(二)电泳检测取DNA溶液5ul，于1. 5%琼脂糖凝胶电泳中检测，120V电压下电泳40min之后，经凝胶成像分析系统观察在点样点附件存在白色的DNA条带，说明DNA提取较好。如图1所7J\ ο(三)PCR检测以提取的DNA为模板，可用标记引物或基因序列引物进行检测，本方法介绍微卫星标记引物的检测方法，其它方法可参照此方法进行。LPCR 扩增PCR 扩增反应体系=DNA 模板(20ng/ μ L) 1 μ L, PCR 反应液(0. 2 μ M dNTPs, 1· 5 μ M MgCl2,0. 5μ M Taq DNA 酶)5yL，引物(0. 5 μ Μ) 1 μ L，去离子水 3 μ L。PCR反应程序为94°C变性5min，然后35个循环，每个循环包括94°C 3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提取河蟹DNA的方法，其特征在于包括如下步骤(1)剪取河蟹绒毛；(2)提取河蟹绒毛DNA，步骤如下a.将第(1)步剪取的河蟹绒毛加裂解缓冲液和蛋白酶K进行消化，其中裂解缓冲液的成分与浓度为:0. 05M EDTA,2% SDS, 0. OlM Tris-Cl，0. 3M 乙酸钠，10mg/ml DTT ；b.将步骤a得到的消化液离心，取上清液加饱和NaCl溶液和氯仿，混勻；c.离心，取上清液加入异丙醇；d.离心沉淀DNA；e.洗涤DNA，轻摇混勻；f.离心，将沉淀DNA烘干；g.在...
【专利技术属性】
技术研发人员：王成辉，周陆，王军，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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