淀粉酶多肽制造技术

本发明专利技术涉及多肽，更具体地为淀粉酶多肽和编码它们的核酸，以及它们的用途，例如在食品或饲料产品生产中作为非麦芽生成性外切淀粉酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】淀粉酶多肽专利
本专利技术涉及多肽，特别是淀粉酶多肽和编码它们的核酸，及其用途，例如在食品或饲料产品生产中作为非麦芽生成性外切淀粉酶。专利技术背景改进的淀粉酶可减轻某些方法中内在的问题，例如在植物淀粉的转换中或烘焙中。烘焙后数天在淀粉颗粒中发生支链淀粉的结晶，这引起面包硬度增加并引起面包陈化。当面包陈化时，面包失去面包心的柔软性和面包心水分。作为结果，面包心变得弹性更小并且面包产生皮革似的外皮。支链淀粉侧链的酶促水解(例如，通过淀粉酶)可减少结晶并增加抗陈化。结晶取决于支链淀粉侧链的长度：侧链越长，结晶越多。大多数淀粉颗粒是由两种聚合物的混合物构成的：支链淀粉和直链淀粉，其中大约75％为支链淀粉。支链淀粉是非常大的分支的分子，其由(1-4)连接相连的α-D-吡喃葡萄糖基单元的链组成，其中所述链通过α-D-(1-6)连接附着以形成分支。直链淀粉是(1-4)连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元的线性的链，具有少数α-D-(1-6)分支。含淀粉的面包产品(例如白面包、由低麸黑麦粉和小麦粉制备的面包以及面包卷(roll))的烘焙是通过在180℃至250℃的范围内在烤箱中烘焙面包生面团15至60分钟而实现的。在烘焙过程中，陡的温度梯度(200℃至120℃)在外层生面团占优势，而在此形成烘焙产品的外皮。然而，由于蒸汽，面包心中的温度在烘焙过程结束时仅为约100℃。超过约85℃的温度，可发生酶失活并且酶将不具有抗陈化特性。因此，只有热稳定的淀粉酶能够在烘焙过程中有效地修饰淀粉。内切淀粉酶活性通过由于分支糊精的累积而产生粘性的或胶粘的面包心，可负面地影响最终面包产品的品质。优选外切淀粉酶活性，因为其实现了引起陈化延缓的所需的淀粉修饰，具有更少的与内切淀粉酶活性相关的负面影响。减少内切淀粉酶活性可引起更好的外切特异性，这可减少分支糊精并产生更高品质的面包。将植物淀粉(特别是玉米淀粉)转化为乙醇是快速扩展的工业。麦芽四糖(G4或DP4)糖浆是源自酶促处理淀粉的许多商业上重要的产品之一。将植物淀粉(特别是玉米淀粉)转化为麦芽四糖和更低的糖(例如葡萄糖或麦芽糖)是快速扩展的工业。当前的方法由引起葡萄糖或麦芽糖产生的两个相继的酶催化步骤组成。然后可使用酵母来将葡萄糖发酵为乙醇。第一个酶催化步骤是淀粉熔解。通常，通过快速加热至85℃或更高而对淀粉悬浮物进行凝胶化。使用α-淀粉酶(EC3.2.1.1)来将粘性熔解物降解为麦芽糊精。α-淀粉酶是催化内部α-1，4-D-糖苷键的随机剪切的内切水解酶。当α-淀粉酶分解淀粉时，粘性减小。因为熔解通常是在高温下进行的，在此步骤中优选的是热稳定的α-淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属(Bacillus)的种的α-淀粉酶。以此方式生产的麦芽糊精通常不能被酵母发酵以形成醇。因此需要第二个酶催化的糖化步骤来分解麦芽糊精。葡糖淀粉酶和/或麦芽生成性α-淀粉酶通常被用于催化熔解后形成的麦芽糊精的非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。脱支酶(例如支链淀粉酶)可被用于辅助糖化。糖化通常在升高的温度、在酸性条件下(例如60℃，pH4.3)发生。G4(也称为DP4)糖浆与蔗糖糖浆相比具有许多有利的特性。例如，在食物中用G4糖浆部分地替代蔗糖减少食物的甜度而不影响其味道或风味。由于其更低的葡萄糖和麦芽糖含量，G4糖浆在食物中具有高保水性并显示出更少的有害的美拉德反应产物。G4糖浆还比蔗糖具有更高的粘性，因而改进食物质地。G4糖浆比蔗糖或高果糖糖浆更少地降低水的冰点，因此G4糖浆可更好地控制冷冻食物的冰点。消化后，G4糖浆还比蔗糖更少地影响渗透压。总之，这些品质使得G4糖浆理想地适于作为食物和医疗产品中的成分。G4糖浆也可用于其它的工业。例如，G4糖浆赋予光泽并可被有利地用作纸张浆料。参见，例如Kimura等人，“Maltotetraose，anewsaccharideoftertiaryproperty，”Starch42：151-57(1990)。用于生产乙醇的酵母之一是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。酿酒酵母含有α-葡糖苷酶，其被显示利用单糖、二糖和三糖作为底物，Yoon等人(CarbohydrateRes.338：1127-32(2003))。可通过Mg2+补给和过表达AGT1通透酶(Stambuck等人，Lett.Appl.Microbiol.43：370-76(2006))、过表达MTT1和MTT1alt以增加麦芽三糖摄取(Dietvorst等人，Yeast22：775-88(2005))、或在细胞表面上表达麦芽糖酶MAL32(Dietvorst等人，Yeast24：27-38(2007))来改善酿酒酵母利用三糖的能力。可以省略糖化步骤，如果熔解步骤产生了足够水平的单糖、二糖或三糖并且酿酒酵母或其经遗传修饰的变体被用于发酵步骤。嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophila)表达形成麦芽四糖的麦芽四糖水解酶(EC3.2.1.60；形成G4的淀粉酶；G4-淀粉酶)。已确定了编码PS4的嗜糖假单胞菌基因的核苷酸序列(Zhou等人，“NucleotidesequenceofthemaltotetraohydrolasegenefromPseudomonassaccharophila，”FEBSLett.255：37-41(1989)；GenBankAcc.No.X16732)。PS4是作为具有N末端21个残基信号肽的前体蛋白表达的。如SEQIDNO：10中所显示的，PS4的成熟形式含有530个氨基酸残基，其在N末端具有催化结构域而在C末端具有淀粉结合结构域。PS4显示内切和外切α-淀粉酶活性。内切α-淀粉酶活性可用于降低凝胶化淀粉的粘性，而外切α-淀粉酶活性可用于将麦芽糊精分解成更小的糖。专利技术概述本专利技术涉及多肽，特别是淀粉酶多肽和编码它们的核酸，及其用途，例如在食品生产中作为非-麦芽生成性外切淀粉酶。本专利技术的淀粉酶被工程化以具有更多有益的品质。具体地，本专利技术的淀粉酶显示出改变的外切特异型和/或改变的热稳定性。特别地，所述多肽衍生自具有非麦芽生成性外切淀粉酶活性(特别是葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶(EC3.2.1.60)活性)的多肽。一方面，本申请中所定义的多肽与SEQIDNO：1的淀粉酶相比具有改进的抗陈化效果。另一方面，本申请中所定义的多肽与SEQIDNO：1的淀粉酶相比具有改进的热稳定性。提供了如权利要求中所列的变体多肽。另一方面，提供了所述变体多肽的用途，如权利要求中所列的，包括用于和用作食物添加剂、食品、烘焙产品、改进剂组合物、饲料产品(包括动物饲料)等。另一方面，提供了如权利要求中所列的编码和涉及变体多肽的核酸。权利要求中还列出了用于生产此类变体多肽的方法，以及其它的方面。附图说明所附的图被并入并作为本说明书的一部分且阐释了各种实施方式。图1显示了与用包含SEQIDNO：1的组合物烘焙的面包相比，用pMS1776(SEQIDNO：12)，pMS2020(SEQIDNO：14)，pMS2022(SEQIDNO：15)和pMS2062(SEQIDNO：16)烘焙的面包的硬度发展。图2显示了与用包含SEQIDNO：1和Novamyl1500的组合物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.05.19 EP 09160655.8;2009.05.19 US 61/179,5251.SEQIDNO:1的多肽的变体，其中所述变体具有淀粉酶活性并且在SEQIDNO:1的位置235处包含氨基酸取代。2.根据权利要求1的多肽的变体，其中所述变体还在至少四个、五个或全部下列位置包含氨基酸取代:88,205,235,240,311或409和/或具有至少一个或两个下列氨基酸取代:42K/N/I/H/F,272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。3.根据权利要求1-2中任一项的多肽的变体，其中所述变体还包含一个或多个下列氨基酸33Y,34N,70D,121F,134R,141P,146G,157L,161A,178F,179T,223E/S/K/A,229P,307K,309P和334P。4.根据权利要求1的多肽的变体，其中所述变体具有至少4个、5个、6个、7个或8个下列氨基酸：42K,88L,205L,235R,240E,272D,311P,392D或409E。5.根据权利要求1的多肽的变体，其中所述变体具有氨基酸223A/K/S。6.根据权利要求1的多肽的变体，其中所述变体在位置88包含氨基酸取代。7.根据权利要求6的多肽的变体，其中所述变体具有氨基酸88L。8.根据权利要求1的多肽的变体，其中1至25之间任意数目的氨基酸发生取代。9.根据权利要求8的多肽的变体，其中所述变体具有氨基酸235R。10.根据权利要求1的多肽的变体，其中所述变体还包含一个或多个下列氨基酸121F,134R,141P,229P或30...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·M·克劳，A·H·凯利特史密斯，R·米科尔森，R·梅吉达尔，R·L·B·詹纳，
申请(专利权)人：丹尼斯科公司，
类型：发明
国别省市：