本发明专利技术提供了一种基于生物信息学的方法挖掘苏云金芽孢杆菌毒性基因的方法。本发明专利技术通过对Bt混合基因组进行测序、数据组装，获得ORFs，与现有功能基因进行比对，鉴定具有同源性的ORFs，再通过基因克隆的方法获得该功能基因，实现了大规模、高通量、经济的新型模式基因的鉴定和挖掘。本方法可以对Bt菌株中所含的基因包括毒性或者毒性相关以及一些功能基因进行挖掘，还可用于对一个地区基因的类型分布的评价。本方法确定的Bt毒力基因可应用于转基因农作物中，使其具备相应抗性，具有重要的应用和经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种鉴定苏云金芽孢杆菌毒性基因的方法及其应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白Gnsectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。自1981年khn印f从菌株HD-IDipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了 390多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类。一般而言，Cryl，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B. thuringiensis subsp. israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性。由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(M cGaughey，W. H. 1985. Science. 229 :193-195)，原因主要是持续使用单品种的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年， McGaughey 报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在 Dipel (Bt subsp. kurstaik HD-I的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik，B E，et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性。为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。而传统的寻找新基因的方法几乎都是基于PCR，常用的方法有多重PCR，PCR-RFLP, Exclusive PCR，随机扩增多态性DNA (RAPD)鉴定，核酸分子杂交，基因芯片，蛋白鉴定。这些方法都有其缺点以及不足，例如采用PCR相关方法需要合成大量的引物，对于不同的基因类型需要进行多次的PCR，十分耗时。核酸分子杂交，则需要合成大量的DNA探针等，这些方法对于一些与已发现的基因同源性低，很新的基因不能有效的识别，因此会失去大量的新模式基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对传统鉴定新基因方法的不足提供一种新的鉴定Bt毒力基因资源的方法。本专利技术的目的还在于提供一种大规模、高通量的获得Bt毒力基因的方法。本专利技术的技术方案如图1所示。本专利技术是混合多株Bt菌株的基因组，进行测序， 通过测序结果的组装，结合与数据库PFAM，GO, KEGG，Trimble的比对结果，提取毒力基因相关的CDS序列，通过NCBI的比对结果对所选的毒力基因相关CDS进行分类，可鉴定出总基因组中所含的基因类型。再根据比对结果设计相应的引物，提取所选菌株的基因组，使用所设计的引物对待测菌株的基因组进行PCR扩增，克隆得到大量的Bt毒力基因。本专利技术提供了一种高通量鉴定细菌功能基因的方法，包括以下步骤(1)选取在光学显微镜或者扫描电镜下具有伴胞晶体的菌株作为目标菌株，提取质粒和基因组后，混合；(2)对混合后的质粒和基因组进行小片段文库测序，将测序数据进行组装，得到测序短序列(reads)组装为长的片段重叠群(contigs)进而组装为一定长度的片段 (scaffolds)；(3)利用软件分析步骤O)中片段(scaffolds)中的开放阅读框ORFs，与生物信息数据库比对进行注释得到与功能基因具有同源性的0RF-1 ；(4)将步骤(3)获得的ORFs-I与现有菌种的功能基因比对，鉴定出与功能基因具有同源性的ORFs-2，即鉴定出总基因组中所含的基因类型。进一步，可根据上述步骤(4)中同源性的ORFs-2设计引物，进行PCR扩增，克隆获得细菌的功能基因。优选地，所述细菌为苏云金芽孢杆菌。优选地，所述功能基因可以为cry、cyt、vip毒力基因、毒力因子调控基因和/或转录基因。其中，步骤O)中所述的数据组装，其参数为kmer 63。其中，步骤(3)中所述的与生物信息数据库为KEGG、PFAM、GO、NR、Swiss-Prot和 / 或 TrEMBL。其中，NR、KEGG、Swiss-Prot和 TrEMBL 采用的是 Blast，其参数为 e-value Ie-5 ； PFAM的注释采用的是hterPrc^can，GO的注释基于NR注释结果的Blast2G0比对。本专利技术提供了上述方法在细菌毒力资源鉴定中的应用。本专利技术还提供了一种大规模获得苏云金芽孢杆菌毒力基因的方法，包括以下步骤(1)选取具有伴胞晶体的晶体类型丰富的Bt菌株，提取质粒和基因组后，混合；(2)对混合基因组进行小片段文库测序，将测序数据进行组装，得到测序短序列(reads)组装为长的片段重叠群(contigs)进而组装为一定长度的片段(scaffolds)；(3)利用软件分析步骤O)中scaffolds中的开放阅读框ORFs，与生物信息数据库KEGG、PFAM、GO、Swiss-Prot和/或iTrEMBL比对，抽提出与功能基因相关的ORFs-I ；(4)将步骤(3)获得的ORFs-I与现有Bt cry/cyt/vip基因比对，鉴定出与cry/ cyt/vip基因具有同源性的ORFs-2 ；(5)根据cry/cyt/vip基因具有同源性的0RFs_2序列设计引物，以所属菌株的基因组为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行克隆，获得Bt毒力基因。由于Bt毒力基因往往具有抗虫性或溶细胞活性，本领域技术人员能够预见，将本专利技术方法中鉴定并克隆的Bt毒力基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达的蛋白重组载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转相应抗性基因的转化体，例如农作物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑爱萍，李巧，李平，朱军，邓其明，李双成，王世全，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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