本发明专利技术设计了肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的特异性引物，并建立了可同时检测这些细菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。所述试剂盒包括：10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群阳性对照DNA，肺炎链球菌引物，b型流感嗜血杆菌引物和结核分枝杆菌复合群引物。该试剂盒可同时快速检测下呼吸道标本中肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）、b型流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzaetypeb）与结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex）。本发明专利技术建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏，可用于肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群感染的快速诊断与流行病学调查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及下呼吸道感染性疾病的分子诊断
，具体涉及多重降落PCR检测方法在下呼吸道标本中肺炎链球菌(份re^iococc^s pneumoniae)、b型流感嗜血杆菌 {Haemophilus influenzae type 办)与结核分枝杆菌复合群層 tuberculosis检测中的应用。
技术介绍
肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌是引起社区获得性肺炎的主要病原菌。肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌疫苗尚未纳入我国的一类免疫规划中。结核分枝杆菌复合群是一群可引起结核的分枝杆菌，包括结核分枝杆菌Ufycobac terium tuberculosis )、 牛分枝杆菌(.Mycobacterium bovis)^ 卡介苗{Mycobacterium bovis BCG)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti )> 卡耐提分枝杆菌 iMycobac terium cane t tii )、海豹分枝杆菌(Mycobac terium pinnipedii )与 Mycobac terium mungi。WHO报道2009年全球有170万人死于结核。当前肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌复合群的常规检测方法基于培养法，操作耗时且灵敏度低。近来，PCR技术改善了细菌检测的灵敏度。Kim，W.等(Kim，W., et al., Identification of the cpsA gene as a specific marker for the discrimination of Streptococcus pneumoniae from viridans group streptococci. Journal of Medical Microbiology, 2010. 59(10) : p. 1146-1152.)发现 c/zsJ 基因可作为检测肺炎链球菌的特异性标志物。Marty, A 等(Marty, A.，et al. , Detection of Haemophilus influenzae type b by real-time PCR. J Clin Microbiol, 2004. 42(8): p. 3813—5.) 建立了基于荚膜位点II区(region II of the capsulation locus，ca/7)特异检测b型流感嗜血杆菌的实时定量 PCR。Hellyer, T 等(Hellyer, T.，et al.，Specificity of IS6110~based amplification assays for Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol. , 1996. 34(11) : p. ^43-2846.)发现基于插入序列 /访770 的 PCR 可特异检测结核分枝杆菌复合群。Korbie，D.J.等(Korbie，D.J. and J. S. Mattick, Touchdown PCR for increased specific!ty and sensitivity in PCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3(9) : p. 1452-1456.)发现降落 PCR 可提高 PCR 的特异性与灵敏度。当前尚无可同时检测肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的多重PCR 报道。本专利技术建立的多重降落PCR可同时直接检测下呼吸道标本中的肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于肺炎链球菌、b 型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群感染的快速诊断与流行病学调查。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可同时快速检测下呼吸道标本中肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群的多重PCR检测试剂盒及检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术发案实现的一种下呼吸道病原菌多重降落PCR检测试剂盒，包括10 X PCR缓冲液，MgCl2, dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌与结核分枝杆菌复合群阳性对照DNA，肺炎链球菌引物，b型流感嗜血杆菌引物和结核分枝杆菌复合群引物；所述肺炎链球菌引物序列为5，_ AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3，(SEQ ID NO. 1)与 5，-GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3，(SEQ ID NO. 2)；所述b型流感嗜血杆菌引物序列为5，- ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3，(SEQ ID NO. 3) 与 5，- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3，(SEQ ID NO. 4)；所述结核分枝杆菌复合群引物序列为5’ - GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3’ (SEQ ID NO. 5)与 5，- CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3，(SEQ ID N0. 6)。本专利技术还公开了应用上述试剂盒的检测方法(一)提取待检样本DNA(二)多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的cpsA、⑵/7基因与IS6110序列，具体步骤如下反应体系25 μ H2O11. 55 μ 缓冲液(10 X PCR)2. 5 μ BSA(10 mg/ml)0. 25 μ Sp_cpsA-F (10 Mmol/L)1 μ Sp_cpsA-R (10 Mmol/L)1 μ Hib_cap-F (10 Mmol/L)1 μ Hib_cap-R (10 Mmol/L)1 μ TB_IS6110-F (10 Mmol/L)1 μ TB_IS6110-R (10 Mmol/L)1 μ MgCl2(25 mM)2 μ dNTP(10 mM)0. 5 μ Taq DNA 聚合酶(5υ/μ1)0. 2 μ DNA模板2 μ 引物肺炎链球菌引物为Sp_cpsA-F :5，- AGTGGTAACTGCGTTAGTCCTA-3，(SEQ ID NO. 1) Sp_cpsA-R 5' - GTGGCGTTGTGGTCAAGAG -3，(SEQ ID NO. 2) b型流感嗜血杆菌引物为 Hib_cap-F 5' - ATGTTAGATCGTGCGGATACTC-3，(SEQ ID NO. 3) Hib_cap-R:5，- GCGAGGAACAGAACCATCAG-3' (SEQ ID NO. 4) 结核分枝杆菌复合群引物为 TB_IS6110-F 5‘ - GGTAGCAGACCTCACCTATGT-3，(SEQ ID NO. 5) TB_IS6110-R :5’ - CTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3' (SEQ ID NO.6) (三)PCR反应循环参数如下940C 5min ；94 V 30s, 65V (每循环降低0.5°C) 30 s, 72V 1 min，20个循环；94 "C 30s, 55 "C 30s, 72°C 1 min, 20 个循环；72°C 7 min ； (四)电本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵世和，罗欲承，徐会娟，杜蓬，段秀杰，侯艳娇，潘红，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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