本发明专利技术公开了一株产新结构细胞毒活性三吲哚化合物的大肠杆菌工程菌19C6及其含的深海宏基因组，该工程菌保藏号为：CCTCC?NO：M?2010245，该基因来源于深海沉积物样品，序列如SEQ?ID?NO?1所示，该工程菌还能够合成一种三吲哚化合物。该基因簇参与工程菌的代谢，使得19C6产生了更丰富的中等极性物质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株产新结构细胞毒活性三吲哚化合物的大肠杆菌工程菌19C6及其含的深海宏基因组。该大肠杆菌插入外源基因总长4203!3bp，其中推测含有完整的phN苯酚降解基因簇，该工程菌还产新结构细胞毒活性三吲哚化合物。
技术介绍
半个世纪来，陆栖微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等生物活性物质的资源，海洋微生物也将成为21世纪开发新型的尤其是抗癌抗肿瘤药品的资源。海洋微生物特别是深海微生物由于生活在高盐、高压及寡营养的特殊环境中，具有独特的代谢方式，因此能产生许多结构新颖、活性独特的次级代谢产物。深海占地球表面积的49%，是地球表面最大的生物栖息场所，深海环境中微生物基因资源的开发具有现实、重要的资源及科学价值。典型深海特征为低温(< 5°C )和高压 (最高达IlOMPa)，据估计在此极端条件下，深海环境中可培养微生物还不到0. 01%。采用宏基因组技术能部分克服传统培养方法的局限性，获得新的科学发现和基因资源。自1998年宏基因技术建立以来，该技术的应用越来越广泛，在酶的开发方面已经取得了不俗成绩。随着宏基因组学技术和谱学技术的发展和完善，基于宏基因组的药物开发亦成为可能。本专利涉及到的一个产具有细胞毒活性得新结构化合物的深海宏基因组文库工程菌，为此类研究奠定了良好基础。为此，提出本项专利技术。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一株的大肠杆菌EPI30019C6 (Escherichia coli EPI30019C6)，该工程菌插入外源基因总长4203!3bp，其中包含完整的phN基因簇，并且产新结构细胞毒活三吲哚化合物。该菌种保藏号为CCTCC NO =M 2010M5，保藏日期为2010年 9月21日，保藏地点为湖北省武汉市武汉大学，保藏机构为中国典型培养物保藏中心。我们从太平洋深海沉积物样品进行富集，提取富集样品DNA建立Fosimid文库，质粒载体(Fosmid，插入片段40 451Λ)，宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)，获得约3000 个克隆子。通过筛选，得到一个工程菌19C6。该工程菌在LB平板上呈现蓝色，同时其LB发酵液的乙酸乙酯初提物在100ug/ml浓度下对HT1080、CNE2、BEL7402肿瘤细胞具有良好细胞毒活性分别为94. 35%,92. 52%,90. 56%。同时该提取物HPLC指纹较空载也表现出明显多样性(见图1)。该插入片段全长42033个碱基对，经过BLAST比对分析推测该片段包含完整和苯酚降解相关的PhN基因簇。附图说明图1 工程菌19C6与空载克隆子指纹图谱对比。图2 所表示的工程菌19C6插入片段基因簇。图3三吲哚化合物1，2，2-三-IH-吲哚-3-基乙酮(TIE)结构图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进ー步的描述，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1本专利技术工程菌的获得本专利技术提供的工程菌是采用以下方法获得的1.深海沉积物样品的富集取出4°C保存的深海沉积物样品10g，于人工海水放线 菌富集500ml培养基中进行富集培养，培养条件为28°，200rpm，10天。2.深海沉积物富集样品DNA提取富集产物30ml，IOOOOg离心15分钟，去上清， 加入 13. 5ml DNA抽提缓冲液(IOOmM Tris-HCl，IOOmM EDTA-Na, IOOmM磷酸钠缓冲液，1. 5M Nacl, CTAB pH 8. 0)，混勻后，加溶菌酶(10mg/ml) ；37度水平振荡30分钟；加入1. 5ml 20% SDS，将其至于65度水浴涡中水浴2小吋，同时每15-20分钟伴随着温柔的颠倒混勻； 将离心管6000g离心十分钟，去上清，沉淀重复洗两次(4. 5ml buffer+0. 5mlSDS，65度， lOmin，离心6000g，10min)此步可以省略；集中三次所得到的上清，加入等体积的酚氯仿， 15000g离心15min ；取水相溶液到另ー离心管中，再加入0. 6倍体积的异丙醇，室温沉淀1 小时；16000g离心20min，得到DNA粗提物；用70%乙醇洗涤，离心之后放置于操作台吹干， 最后用去离子水溶解。3.深海沉积物富集样品宏基因组文库的构建A. DNA 剪切提取环境样品或所富集菌体的DNA，用琼脂糖凝胶电泳进行检测B. DNA 选择1.切下片段大约40K至4 的DNA，，在70. C溶胶lOmin，按Img固体胶溶解后体 积为 1 U 1 计算，加入 GELase 50XBuffer, ^ 100 U 1 月交加入 IU GELase Enzyme, 45. C 水浴 1 小吋。2. 70. C 水浴 IOmin,灭活 GELase Enzyme3.离心去除未被降解的琼脂。4.加入1/10体积醋酸钠，温柔混勻。5.加入2. 5倍体积的无水乙醇，温柔混勻。6.室温沉淀 IOmin.7. 13000rpm/min 离心 20min，小心吸除上清8.将沉淀用预冷的70 %乙醇洗两次9.吹干后将 DNA 溶于 TE Buffer.C. DNA末端补平1.补平体系X U 1 无菌水8u 1 IOX End-Repair Buffer8u 1 2. 5mM dNTP Mix8u 1 IOnM ATPUp to 20 U g sheared insert DNA (约 0. 5u g/u 1)4yl End-Repaie Enzyme Mix80 ill总反应体积2.室温放置 45min.3.加入酚-氯仿抽提4.取上清，加入1/10体积醋酸钠，温柔混勻。5.加入2. 5倍体积的无水乙醇，温柔混勻。6.-20. C 过夜沉淀。7. 13000rpm/min 离心 20min，小心吸除上清8.将沉淀用预冷的70 %乙醇洗两次9.吹干后将 DNA 溶于 TE Buffer.D.连接反应1.连接体系X U 1 无菌水1 u 1 IOX Fast-Link Ligation BufferIiil IOmM ATP1u 1 CopyControl pCClFOS VecterXli 1 concertrated insert DNA1u 1 Fast-Link DNA Ligase10 ill总反应体积2.室温放置连接2个小时3.反应体系置于70C，10分钟，灭活DNA Ligase.E.克隆子制备1.将EPI300转入已添加IOmM MgS04的LB液体培养基中，培养至OD达到0. 8-1. 0， 4度保存菌液可保存72小吋。2.置冰上融化一管包装蛋白，当融化时迅速吸出25 U 1到一个新的离心管中。剩 下的25Pl仍然置于-70. C接下去使用。3. 25u 1包装蛋白中加入IOiU连接反应产物。4. 30. C 水浴 90min.5.加入另外25 ill包装蛋白，30. C水浴90min.6.カロ入 Phage dilution buffer 940 U 1,使总体积达到 lml. 2.质粒酶切图谱分析最终获得约3000个克隆子，得到一个LB平板上呈现蓝色的克隆，同时其LB发酵液的乙酸乙酯初提物在100 μ g/ml浓度下对HT1080、CNE2、BEL7402肿瘤细胞具有良好细胞毒活性分别为94. 35%,92. 52%,90. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤熙翔，肖湘，易志伟，王风平，秦丹，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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