本发明专利技术公开一种疫苗黏膜免疫佐剂分子的制备方法，主要运用将不同亚基或全蛋白质分别构建于不同的表达框以调节多亚基蛋白LT、突变体及其亚基的表达量，以克服多亚基复杂蛋白对其整体进行基因表达效能降低的问题，从而促进疫苗黏膜免疫佐剂的有效制备。这种对疫苗黏膜免疫佐剂大肠杆菌热敏感毒素LT（heat-labiletoxin,LT）突变体及其亚基的制备方法，不仅适合于LT及其突变体与亚基本身的有效制备，制作工艺程序简便、快捷，而且也对类似结构的多亚基蛋白质，包括酶，建立了一种在基因水平分别构建、组合表达，以最终实现在蛋白水平的按比例、有活性的组合制备完整蛋白的技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药与疾病免疫领域，更具体地讲，涉及应用于生化制药等领域的经皮肤与粘膜免疫的疫苗佐剂，主要应用于人或动物的预防传染病或肿瘤方面的疫苗， 建立了一种类似于LT突变体及其亚基的多亚基复杂结构的蛋白制备方法。
技术介绍
各种传染病的不断发生，对现有的疫苗提出了新的挑战。比传统更加简便、快捷、 更有利于大规模的接种的粘膜免疫疫苗，已成为目前国内研究的新方向。安全有效的粘膜免疫佐剂正成为粘膜免疫疫苗的关键。大肠杆菌热敏感毒素(heat-labile toxin, LT)是目前世界上公认的免疫效果最好的之一。因此，采用基因工程技术高效制备减毒且可作为粘膜免疫佐剂的LT突变体(LTm)及其亚基已成为国内外研究普遍追求的目标。但是，由于LT结构的特殊性与复杂性，主要表现在下列方面LT基因可以编码两种蛋白亚基，电泳结果显示一个分子量约为^KD、另一个约为12KD，LT在细胞中为稳定的二亚单位蛋白。LT分子量为87KD，国外科学家已经过一系列的交联实验及纯化、电泳已确认，LT是由1个约^KD的A亚基(LTA)和5个约12KD的B亚基(LTB)组成的6聚体结构蛋白，国外的有的学者将其形象的比喻成“月球车”。经研究表明，LT操纵子含有两个基因，即编码A亚基单位的toxA基因和编码B亚单位的toxB基因，并转录成一条mRNA链，二者首尾相接4bp，LT_A的基因编码区长76^p， 编码2M个氨基酸，eltA上游约-76至_43bp处为启动子序列，其中_76至-7Ibp区GCATAT 和-49至-4;3bp区GTTATCT均为启动子信号序列，核糖体结合位点TAAG位于起始密码子 ATG上游-13至-IObp区W3]。而eltB起始于eltA末端，LT-A的C末端的最后的两个密码子(TTATGA)与LT-B的N末端的两个密码子(ATGAAT)重叠，这表明eltA和eltB由同一启动子操纵，eltA和eltB可能以共转录的方式合成mRNA。B亚基虽然离启动子比较远，但是B亚单位比A亚单位表达量高很多，可能与其调控装置有密切的关系，通常认为是由于toxB在mRNA上可能与核糖体的结合更加的牢固导致。在LT全蛋白中，A、B亚基比例是1 :5，但是这并非是A亚基和B亚基在大肠杆菌真实表达量情况。在利用同位素示踪法掺入对A、B单位的分泌及全毒素装配动力学的研究发现， 在细胞周质中的比例为1. 4-1. 7A/5B，其中绝大部分的B和A结合在一起，只有55%_60%的 A和B结合，而多余的A亚基则被菌体自身降解。B亚单位被合成以后一分钟内就被分泌到细胞的周质中，约80%会迅速的聚集成寡聚体。X射线晶体结构分析表明，B亚基单位有两组分别由三个反平行的β片层结构、 一个N末端的α螺旋和一个长的位于中心的α螺旋组成，N末端的α螺旋通过二硫键与 β 5片层连接。Β5聚体与A亚单位相邻面平行，而中心的α螺旋从另一面向外延伸，形成一个由50-60为氨基酸组成的小环，按这种结构合成的肽段可诱导机体产生抗LT的抗体。 Β5聚体间只有相邻的单体间有相互作用，5聚体形成后，原表面39%都会包埋起来，有利于维持Β5聚体结构的稳定。其中心的α螺旋有25个阳离子和15个阴离子，可以形成一个强的亲水区，虽然B5的离子中心里亲水性很强，但是只有几个特异性结合的相互作用力， 即空洞中心两头的两个疏水键和一个离子键。电镜观察显示，围绕这个中心的5个亚基结合成一个非常紧密的环状结构。A亚基单位呈三角形结构，由两个功能不同亚单位组成有酶活性的Al亚单位和一个短的连接B5聚体的Al亚单位的A2 β片层。Α2亚单位由一个结构域，含有较短的9个α螺旋和9个β片层。Α2亚单位起始于第200位氨基酸残基，是 Al的一个延伸α螺旋，在结构上它起始于三角形的一个角上。因此，利用通常的基因工程技术制备实践证明有较大的困难。在采用大肠杆菌作为表达宿主制备LT的过程中，LT在大肠杆菌中的表达量非常的低，只有1-5%。有研究表明，在LT基因正常表达形成LT蛋白的过程中，不到50%的LTA亚基与LTB亚基进行了结合装配成ΑΒ5形式。通过调节LTA亚基和LTB亚基的表达量上的比例关系来达到提高LT的产量已成为热点之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，所述黏膜免疫佐剂为大肠杆菌热敏感毒素LT、大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm以及大肠杆菌热敏感毒素亚基蛋白LTA与LTB。为实现以上目的，本专利技术公开以下技术方案，所述黏膜免疫佐剂为大肠杆菌热敏感毒素LT、大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm以及大肠杆菌热敏感毒素亚基蛋白LTA与LTB，其特征在于，将不同亚基蛋白LTA、LTB或全蛋白质LT分别构建于不同的表达框以调节多亚基蛋白LT、突变体及其亚基的表达量。利用P⑶FDuet-I和ρ ΒΙΙ两类载体，在基因水平将LT突变体或其LTA 或LTB亚单位基因或LTA的突变体LTAm的原核表达载体ρ⑶FDuet-1-LTAm-LTB、 pCDFDuet-l-MCSl-LTm、ρCDFDuet-1-LTB-LTm、ρCDFDuet-1-MCS 1-LTB、 pCDFDuet-l-LTB-LTm、pTYB 11-LTB-EGFP, pTYBll-LTB 或 pTYBll-LTm 中的一种或几种转化到BL21感受态细胞中。表达质粒优选为pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-MCSl-LTm 或者 ρ ΒΙI-LTB 中的一种或几种。工程菌BL21/pITBlI-LTB的诱导表达条件为在2ΧΥΤ培养基之中，在37°C生长到0D600=0. 8后，转至20°C下培养，以IPTG终浓度0. 4mM进行诱导8h。本专利技术所述大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm是指既能降低蛋白本身毒性，又能保持免疫活性的突变体，主要包括但不限于LTm7，LTm63，LTmll2，LTml92。本专利技术所述LTA的突变体LTAm其突变位点的要求与UTm相同，主要包括但不限于LTAm7，LTAm63, LTAml 12, LTAml92。本专利技术的优点在于本专利技术主要运用将不同亚基或全蛋白质分别构建于不同的表达框以调节多亚基蛋白LT、突变体及其亚基的表达量，以克服多亚基复杂蛋白对其整体进行基因表达效能降低的问题，从而促进疫苗黏膜免疫佐剂的有效制备。这种对疫苗黏膜免疫佐剂大肠杆菌热敏感毒素LT (heat-labile toxin, LT)突变体及其亚基的制备方法，不仅适合于LT及其突变体与亚基本身的有效制备，制作工艺程序简便、快捷，而且也对类似结构的多亚基蛋白质，包括酶，建立了一种在基因水平分别构建、组合表达，以最终实现在蛋白水平的按比例、有活性的组合制备完整蛋白的技术。通过的疫苗抗原，为黏膜疫苗经皮肤、粘膜产生免疫效应起到转运和协助抗原发挥免疫应答功能的作用。其中所述的黏膜免疫佐剂包括LT本身、LT单点或多点突变体、亚基蛋白LTA与LTB。所涉及的蛋白分子主要应用于生化制药等领域的经皮肤与粘膜免疫的疫苗，优先应用于“旅游者腹泻”、各类流感粘膜疫苗、手足口病、口蹄疫等易于经过呼吸道、 消化道、生殖道等与环境相曝露的黏膜与皮肤的传染病疫苗。本专利技术的应用领域不局限于预防传染病的疫苗，还适用于抗肿瘤方面的疫苗；其应用对象不限于本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马兴元，姚碧，郑文云，刘琨，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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