杂色鲍钙调蛋白cDNA序列制造技术

本发明专利技术公开了一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，它的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所述。本发明专利技术提供的钙调蛋白基因在鲍鱼中属于首次发现，并且只在鲍鱼的重要的免疫器官鳃中表达。由于弧菌病原的感染能够上调其表达，说明该钙调蛋白基因在鲍鱼免疫抗病反应中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学及功能基因应用相关领域，尤其是涉及杂色鲍钙调蛋白 cDNA序列。
技术介绍
钙调蛋白(Calmodulin)是一种存在于几乎所有的真核细胞中的钙结合蛋白。它与 Ca2+结合后可以进一步结合多种目标蛋白，从而调节包括炎症反应、代谢、细胞凋亡、肌肉收缩、胞内运动、短期和长期记忆、神经生长及免疫反应等多种生理过程。因此，钙调蛋白属于细胞信号通路中的上游关键基因，其表达量的上调或下降会引起下游信号途径中一系列多种多样的反应和变化。目前，尚未在鲍鱼物种中鉴定到钙调蛋白相关基因及产物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列。本专利技术以杂色鲍为材料，提取全组织(肌肉和内脏团)的总RNA，进行反转录后cDNA。然后对所得的cDNA进行sfil酶切，分别割胶回收0. 5 1和广31Λ之间的片段，并与pDNR-LIB载体连接转化大肠杆菌DHlOB感受态，建立cDNA文库。通过生物信息学的方法从众多序列中鉴定到一个与已知钙调蛋白基因序列相似的序列。根据鉴定得到的基因序列设计特异引物，上游引物5 ’ -CGAAACATTTCTGTGAAT-3 ’；下游引物 5 ’ -TGAGGTCATTACATGGAG-3 ’。以文库中钙调蛋白cDNA序列为模板，采用上述特异引物进行PCR扩增得到杂色鲍钙调蛋白基因序列，其具有钙调蛋白的保守结构域及活性中心， 其四个保守结构域分别位于蛋白序列的16 — 36、45— 72和84—109和118 —145区间； 第一个保守结构域的活性中心包括Asp-20、Asp-22、Asn-24和Glu-31 ；第二个保守结构域的活性中心包括Asp-56、Asn-58、Asn-60和Glu_67 ；第三个保守结构域的活性中心包括Asp-93、Asp-95、Ser-97和Glu-104 ；第四个保守结构域的活性中心包括Asp_129、 Asn-131、Asp-133 和 Glu-HO0本专利技术所得的杂色鲍钙调蛋白基因序列，其具体DNA核苷酸如下cattagattgccgtcttgtataacaaaggcgaaacatttctgtgaatccgagtccgagcg60atgtccaatctgtcgcagagggagaaacagctgtacaccaggttcttccaccaggtggac120attgatggaaacgggtacatcaccctggatgaactagcaaccttgtgcaaaaaactcaag180ctcggcttgacgcgacaacagattgtggacgtgtttatgaacatggacaccgacaacaac240ttgaccattaccttaaacgaattcttgtcggcaatgccaaagattgaacgtgaacaactc300tcgtatggtgagatgaggtgggcatttgaccagatagacacagatggcagcggcctgctt360gacgctgatgagctgaaggaagtgctgctcaaatgtggacgttcattgacgttgtcacaa420gtgaagactatgattgccaaagtcgacatcaacggtgacggcaaattgaactttgatgaa480tttattactctttttggctaagactacgtactccatgtaatgacctcagttcgacgaacg540tcaaagttgagtgatggttgttcctaacgtCgtg574其相应的氨基酸序列如下Met Ser Asn Leu Ser Gln Arg Glu Lys Gln Leu Try Thr Arg Phe151015 Phe His Gln Val Asp lie Asp Gly Asn Gln Tyr lie Thr Leu Asp16202530 Glu Leu Ala Thr Leu Cys Lys Lys Leu Lys Leu Gly Leu Thr Arg 31 35 40 45 Gln Gln lie Val Asp Val Phe Met Asn Met Asp Thr Asn Asn Asn 46 50 55 60 Leu Thr lie Thr Leu Asn Glu Phe Leu Ser Ala Met Pro Lys lie 61 65 70 75 Glu Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gly Glu Met Arg Trp Ala Phe Asp 76 80 85 90 Gln lie Asp Thr Asp Gly Ser Gly Leu Leu Asp Ala Asp Glu Leu 91 95 100 105 Lys Glu Val Leu Leu Lys Cys Gly Arg Ser Leu Thr Leu Ser Gln 106 110 115 120 Val Lys Thr Met lie Ala Lys Val Asp lie Asn Gly Asp Gly Lys 121 125 130 135 Leu Asn Phe Asp Glu Phe lie Thr Leu Phe Gly136140145本专利技术根据拼接好的钙调蛋白基因cDNA全序列，设计合成一对引物，上游引物(e291F56) GGTCGGATCCATGTCCAATCTGTCGCAGAG,引入 BamH I 酶切位点；下游引物 (U91R540):GTCGAAAGCTTGTCATTACATGGAGTACGTAGTCTTAGCC，引入 HindIII 酶切位点。对杂色鲍的cDNA进行PCR扩增，将扩增产物和表达载体pRSETA分别同时用BamHI和HindIII内切酶切割，使用T4 DNA Iigase将载体与片段连接，再将连接产物热激法转化到BL21(DE3) PlyS菌株中，然后对阳性克隆进行培养，得到钙调蛋白融合蛋白，该蛋白具有较强的钙离子结合活性。本专利技术还通过对杂色鲍各组织的钙调蛋白表达丰度进行了 RT-PCR分析，发现 该基因只在鳃中表达。本专利技术的优点钙调蛋白基因在鲍鱼中属于首次发现，并且只在鲍鱼的重要的免疫器官鳃中表达。附图说明图1是杂色鲍肌肉和内脏团总RNA电泳图； 1 肌肉总RNA ；2 内脏团总RNA。图2是杂色鲍cDNA的一链和二链的合成与均一化电泳图； M :DL2000 plus ；泳道 1 :LD_PCR 扩增 cDNA 双链结果；泳道2:11个循环的Control ；泳道3 :1/4倍DSN酶处理； 泳道4 1/2倍DSN酶处理；泳道5 1倍的DSN酶处理；泳道6 :1倍DSN处理的样品再次PCR扩增12个循环。图3是菌落PCR鉴定插入片段电泳图； A图插入片段为0. 5-lkb的文库克隆；B图插入片段为1-31Λ的文库克隆； M: DL2000 plus。图4是杂色鲍钙调蛋白基因与其它物种中钙调蛋白基因Clustalw聚类分析结^ ο图5是RT-PCR检测钙调蛋白在鲍鱼各组织中的表达的电泳图； 其中，actin为内参基因。图6是大肠杆菌(BL21)中诱导表达钙调蛋白的电泳Ihour和Shour分别为钙调蛋白表达载体在大肠杆菌中诱导表达1小时和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：姜敬哲，王江勇，刘广锋，王瑞旋，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：