本发明专利技术公开了一种快速高效提取饮用水中总DNA的方法，属于饮用水中总DNA抽提与纯化技术领域。针对饮用水中微生物量极低、传统的过滤浓缩方式难以提取到有效浓度的总DNA、复杂环境介质影响抽提的DNA纯度等问题。其步骤为：通过净水装置过滤饮用水中微生物；采用超声将微生物从滤料上洗脱；用滤膜过滤洗脱液；直接用物理研磨和化学裂解相结合的方法抽提滤膜上微生物的总DNA。最后用无水乙醇洗涤，晾干后溶于超纯水或缓冲液中。本方法经济、方便、稳定，抽提获得的DNA浓度和纯度较高，为环境分子生物学技术的应用提供了新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种从饮用水提取总DNA的系列方法集成，更具体的说是从饮用水提取总DNA中快速高效提取总DNA的方法。
技术介绍
饮用水安全与人类健康息息相关，研究报导饮用水中微生物的群落结构、行为归趋与众多疾病的发生有着密不可分的关系，其健康风险不容忽视。而从总DNA水平上对饮用水中微生物的研究是众多重要分析手段之一。消毒后的饮用水生物量极低，传统的过滤浓缩方式难以提取到有效浓度的总DNA。 在以往的研究中，研究者常常用其他间接方式获取饮用水中总DNA，如采集饮用水储存池， 管道、水龙头、水表中的生物膜(Hong, P. Y.，Hwang, C. C.，Ling, F. Q.，Andersen, G. L. , LeChevallier, Μ. W. , and Liu, W. Τ. 2010. Pyrosequencing analysis of bacterial biofilm communities in water meters of a drinking water distribution system. App 1. Environ. Microbiol. 76，5631-5635.)，或者利用自制的生物膜收集装置来获得生物膜 Schwartz, Τ.，Kohnen, W.，Jansen, B.，Obst, U.，2003. Detection of antibiotic-resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. Ferns. Microbiol. Ecol. 43, 325-335.)。这些方法确实能获取环境样品中的总DNA，但同时也存在一系列问题。生物膜形成过程中其微生物群落结构，功能形态不可避免的将发生改变 (Stoodley, P. , Sauer, K. , Davies, D. G. , Costerton, J. W. , 2002. Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol. 56, 187-209·),其不足以确切地反映饮用水中微生物的真实情况。同时生物膜形成时间较长(Kalmbach，S., Manz, W. , Szewzyk, U. , 1997. Dynamics of biofilm formation in drinking water: Phylogenetic affiliation and metabolic potential of single cells assessed by formazan reduction and in situ hybridization. Ferns. Microbiol. Ecol. 22, 265-279.)，难以在短时间内快速获得总DNA样品。
技术实现思路
1.专利技术要解决的技术问题针对现在无法直接从饮用水中提取到总DNA，或者提取方法存在速度慢，准确性差的情况，本专利技术提供一种快速高效提取饮用水中总DNA的方法，采用一系列方法解决从样品采集到总DNA提取的问题，可以提高总DNA提取的速度和效率，为后续在总DNA水体上进行研究奠定了基础。2.本专利技术的技术方案本专利技术的具体实行方案及简单原理如下 一种快速高效提取饮用水中总DNA的方法，其步骤为第一步采样及样品前处理。首先选取合适的采样点，要求出水水质达标，水中无明显颗粒状杂质，水压正常。 打开取样口水龙头，常速空放5分钟，去除水管中滞留的死水，然后用酒精灯灼烧水龙头， 杀灭水龙头附近的细菌。在灭菌的水龙头上安装一种家庭型净水器(型号=Torayvino MK2-EG)，安装方法根据不同类型水龙头而不同，具体可参照该净水器的说明书。安装完成后，打开水龙头，让水从该净水器的滤芯出水口出水，开始计时滤水，直至该滤芯被彻底堵住后方取下，根据水压不同滤水时间一般为M-36小时，过滤水总量在1500-2000升。而直接用普通真空泵和 0. 45微米滤膜过滤最大水量在8-10升(视水质情况而有所不同)，此种滤水方式极大提高了滤水的速度和体积。过滤完成后及时将净水器关闭取下，卸下滤芯，用钢锯将滤芯前端查看窗部位打开，取出里面多层的中空丝膜，放置到灭菌的500毫升烧杯中，加入200毫升超纯水，轻轻震荡让中空丝膜均勻散落在烧瓶中。然后将烧杯放置于超声波清洗机中超声振荡20分钟(型号KuDos HK3310HP ；频率53Khz)，超声后将每100毫升水在0. 98兆帕大气压下过0. 45微米醋酸纤维酯滤膜，滤膜放置4度冰箱留作下一步使用。第二步饮用水中总DNA提取。饮用水中总DNA的提取采用的是MP Biomedicals公司的FastDNA @ SPIN Kit for Soil。首先将滤膜尽量剪碎，将碎片装入到2毫升的样品裂解管，按照该试剂盒的操作指南做如下处理，本步骤采用的离心机型号均Eppendorf centrifuge 5424。(1)在样品裂解管中加入978微升磷酸盐缓冲液和122微升MT缓冲液。(2)用研磨珠均质器(型号=BioSpec Beadbeater-I)在4800转/分钟条件下裂解90秒，彻底破碎微生物细胞。(3)将样品裂解管在14000 g转速下离心15分钟。(4)将离心后管内的上清液转移到新的2. 0毫升离心管中，加入250微升蛋白沉淀溶液，充分振荡2分钟。(5) 14000g下再次离心5分钟去除沉淀，将上清液全部转移到干净的15毫升离心管中。(6 )将一种能结合DNA溶液振荡摇勻后，加1毫升该溶液到15毫升离心管中。(7)用涡旋振荡器振荡离心管2分钟后将离心管放在支架上静止3分钟，让溶液中的二氧化硅颗粒沉淀。(8)去除500微升上清液。(9)将离心管中剩下的混合物重新混勻，取600微升溶液到离心过滤柱上， 14000g离心1分钟后，去除收集管中的液体。重复上述过程，继续将剩下的混合物加入到过滤柱上离心。(10)加500微升的SEWS-M溶液到离心柱中，用移液枪轻轻吹打溶液，将里面混合物彻底混勻。(11) 14000g离心1分钟，丢弃收集管中液体。(12)不加入任何试剂，14000g离心2分钟，去除离心柱中残留的乙醇，丢弃原收集管，换上一个新的干净的1. 5毫升离心管。(13)将离心柱在室温下空气干燥5分钟。(14)先加入50微升55度预热的无菌水到离心柱中，用移液枪轻轻搅动，若溶解不完全，则在加入10微升无菌水搅动，直至离心柱中二氧化硅全部成熔融状态。(15)将离心柱放置55度烘箱中加热5分钟。(16) 14000g离心1分钟后，离心管中收集到得液体即提取所得饮用水中总DNA， 零下20度保存。在完成上述两步后，可以进行总DNA浓度和纯度鉴定。总DNA浓度和纯度鉴定可采用分光光度法和琼脂糖电泳法。具体方法和步骤如下分光光度法在沈0纳米波长下的吸光度值可以定量总DNA的浓度，A^0/A280指示总DNA的纯度。 本专利技术用分光光度法测定饮用水中总DNA浓度和纯度所用仪器为Bio-tek公司的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张徐祥，施鹏，贾舒宇，马黎萍，吴兵，李爱民，程树培，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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