一种新型脑肠肽激动剂分子的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种新型脑肠肽激动剂分子制备方法及其应用，本发明专利技术用生物信息学软件计算得出新型脑肠肽激动剂分子的合理构象，并完成了其与脑肠肽的分子对接，进一步利用PCR技术扩增了新型脑肠肽激动剂分子基因。该脑肠肽激动剂分子可作为长效药物用于2型糖尿病的治疗。

【技术实现步骤摘要】

一种新型脑肠肽激动剂分子制备方法及其应用，属于蛋白质药物

技术介绍
在人体内，有些肽类在胃肠和神经系统双重分布，称为脑肠肽(braingutpeptide)。脑肠肽不仅在外周广泛地调节着胃肠道的各种功能，而且在中枢也参与对胃肠道生理活动的调节。脑肠肽类蛋白质可作为药物用于治疗多种疾病，如糖尿病等。药代动力学研究表明，多肽/蛋白类药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除，其中分子量小于20kDa的多肽因子在代谢过程中易被肾小球滤过，通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而多肽因子的半衰期短。为了达到治疗效果，需要频繁的大剂量用药，长期的频繁注射不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易引发一系列严重的毒副作用。因此寻找新型长效的蛋白质/肽分子一直是药物邻域研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型脑肠肽激动剂分子，其核苷酸序列如附图1所示，简称GGH。本专利技术的目的还在于提供一种GGH的制备方法。本专利技术的目的还在于提供一种毕赤酵母高产菌株KM71 (pPIC9K-GGH)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4892，保藏日期为2011年5月24日。本专利技术的目的还在于提供一种毕赤酵母高产菌株KM71 (pPIC9K-GGH)的制备方法。为了实现上述目的，本申请人做了如下工作。用生物信息学软件hsightll、ICMpro、Amber计算得出新型脑肠肽激动剂分子的合理构象，并完成了其与脑肠肽的分子对接，进一步利用PCR技术扩增了新型脑肠肽激动剂分子基因。首先利用DNA合成仪合成了将GLP-I的N末端第二位的丙氨酸突变为甘氨酸的核苷酸序列(GLP-lA2e)2，然后选择(GLP-lA2e)2作为目标分子与人白蛋白融合表达，即采用蛋白质融合技术。利用白蛋白分子质量大的性状将药物的易致机体产生过敏的部分包裹，使药物蛋白的活性部分暴露。利用重叠PCR技术，在体外成功拼接(GLP-lA2e)2基因和HSA基因，得到融合基因(GLP-lA2e) 2_HSA，简称GGH。由于大肠杆菌表达系统的不足，本申请人还构建了毕赤酵母高产菌株KM71 (pPIC9K-GGH)，使GGH可以高效表达，并实现产业上的应用。本申请人将GGH与毕赤酵母的分泌型多拷贝质粒PPIC9K连接，线性化之后通过电转到毕赤酵母KM71中，通过G418筛选，经G418抗性筛选得到能耐受:3mg/mL G418重组菌12株，耐受％ig/mLG418重组菌5株，进行甲醇诱导表达，筛选得到1株表达量高的重组菌KM71(pPIC9K-GGH)，表达量为ie^iig/L0此外，申请人将获得的GGH进行了一系列的小鼠实验显示了该目标蛋白的具有良好的生物活性和较长的半衰期。GGH在体外对胰岛原代细胞有较好的刺激作用，在浓度45nmoL时增殖率为35. 4%，与单体的GLP-I相差不大。在糖耐量实验中，GGH可以较好的控制小鼠的血糖水平，并且在给药7 后中、高剂量组仍然有生物活性，而单体的GLP-I在给药4h后就检测不到生物活性。附图说明附图IGGH融合基因序列附图2在含％ig/mLG418的MD平板上长出的菌落表达情况附图3PCR验证pPIC9K-GGH的KM71阳性转化子附图 4GGH 的 Western blot 鉴定附图5GGH对胰岛细胞的增殖作用附图6不同时间小鼠的血糖增量附图7GGH与其他类似物药效比较具体实施例方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1重组表达质粒pPIC9K-GGH的构建本实施例中所使用的培养基配方如下LB培养基胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠lOmmol/L，pH 7. 0。需要时使用前加入100 μ g/mL氨苄青霉素，固体培养基添加15g/L琼脂，用于大肠杆菌培养。SOC培养基胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠lOmmol/L，氯化钾2. 5mmol/L，氯化镁 10mmol/L，硫酸镁 20mmol/L，葡萄糖 20mmol/L，pH 7. 0。YPD培养基胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L。固体培养基添加15g/L琼脂，用于酵母菌培养。MD培养基葡萄糖20g/L，不含氨基酸的酵母氮基化他)13.48/1，生物素4\10_48/L。固体培养基添加15g/L琼脂，lmol/L山梨醇，用于毕赤酵母转化物培养。也可加入适当量的G418，用于高拷贝整合的毕赤酵母基因工程菌的筛选。BMGY培养基胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，1 OOmmo 1/L磷酸钾pH6. OYN13.48/1，生物素4\10_、/1，甘油10g/L。用于毕赤酵母基因工程菌的培养。BMMY培养基胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，IOOmmo 1/L磷酸钾pH6. OYNB13. 4g/L，生物素4X 10_5g/L，甲醇5g/L。用于毕赤酵母基因工程菌的诱导表达。本实施例中所使用的引物具体序列如下PLl :5’ -GAGAGGTACGTAAAAAGACACGGTGAAGGTACTTTCACT-3>PL2 :5’ -ACCAACATTTTCCTTCCCTACGTGTGTTCTCAACTCCA-3’PHl :5’ -TGGTT GTAAAAGGAAGGGATGCACACAAGAGTGAGGT-3，PH2 :5’ -TGAACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG-3'引物PL1、PL2用于GLP-Iam串联体基因的PCR ；引物PH1、PH2用于HSA基因的PCR ；引物PL1、PH2用于GGH的重叠PCR。1. (GLP-1A2G) 2 和 HSA 基因的 PCR 扩增(1)用购自生工生物工程(上海)有限公司的质粒DNA小量制备试剂盒提取重组质粒 pBlu2SKP-(GLP-Ia2g)2 和 Vector-HSA，保存于 _20°C备用。(2)以质粒 PBlu2SKP-(GLP-Ia2g)2 为模板，PLl 和 PL2 为引物，PCR 扩增(GLP-Ia2g)2基因。PCR反应采用高保真DNA聚合酶pfu，在0. 2mL薄壁管配置如下反应体系pBlu2SKP-(GLP-Ia2g)21.0 H L IOXpfu Buffer 5. 0 u LdNTPs (2 mmol/L)5.O u LPLl GO umol/L)1.5 U LPL2 (10 umol/L)1.5 u L pfu polymerase (5 U/ y L) 0. 3 u L加ddH20至总体系为50 μ L加入25 μ L矿物油后，将反应管置于PCR仪上，当体系温度升至65 °C后加入pfupolymerase 1. 5个单位，进行PCR反应，PCR反应条件如下95°C 预变性 IOmin ；95°C变性 45s，56°C退火 45s，72°C 延伸 30s，循环 30 次；72°C 延伸 IOmin ； 10°C保温。(3)以质粒Vector-HSA为模板，PHl和PH2为引物，PCR扩增HSA基因。PCR反应采用高保真DNA聚合酶pfu，在0. 2mL薄壁管配置如下反应体系Vecto本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金坚，许正宏，窦文芳，陈蕴，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：