一种提高植物细胞壁中纤维素含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高植物细胞壁中纤维素含量的方法。本发明专利技术提供了一种培育转基因植物的方法。本发明专利技术所提供的培育转基因植物的方法，是降低目的植物中4-香豆酸：CoA连接酶编码基因的表达，得到与所述目的植物相比，细胞壁中纤维素含量提高的转基因植物。本发明专利技术通过转基因技术和反义RNA技术结合，获得4CL基因表达受到抑制的转基因杨树，转基因杨树成熟木材的细胞壁中纤维素含量显著增加，转基因植株较野生型对照植株细胞壁中纤维素含量增加了3％-7％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中。
技术介绍
纤维素是木材的主要组分，是地球上具重要经济价值的可再生资源，自然界每年可生产约1，800亿吨的纤维素。并且，由于木材包含木本植物光合作用产生的绝大部分生物量，因此林木是人类最主要的可再生资源，与国计民生息息相关，更是制浆造纸工业、建筑业、纺织业以及新兴的生物能源产业的重要原材料。木材为木本植物的次生木质部，其中次生细胞壁构成了木材的绝大部分生物量， 它的形成主要依赖于次生木质部的年度周期性生长和累加，即通常所说的植物次生生长。 次生细胞壁形成直接关系到纤维生物质的积累，这一过程主要包括纤维素和半纤维素、木质素等生物合成及组装。特别是纤维素的定向排列和木质素的沉积是次生细胞壁形成过程中的标志性事件。木材中通常纤维素含量约占45 %，半纤维素约占30 %和木质素约占25 %，通常称为木质纤维素生物质。它是制浆造纸工业的重要原料之一，也是高档纸品生产的主要原料， 生产中利用的主要成分为其中的纤维素。而木质素则需要在制浆过程中利用大量的化学品从原料中分离，留下的纤维素用于造纸。在生物能源产业中，利用木质纤维生物质材料生产乙醇已成为第二代生物基液体燃料研究的热点。目前已经市场化的生物燃料主要包括以粮食为加工原料的第一代生物乙醇和以植物油为加工原料的生物柴油，这两种生物燃料的发展都遭遇了生产原料不足的瓶颈问题。与之相比，第二代生物燃料纤维素乙醇的发展因原材料充足，显示出巨大的产业应用潜力。因此，我国《能源发展“十一五”规划》、《可再生能源中长期发展规划》等一系列政策法规中明确提出“积极发展以纤维素生物质为原料的生物液体燃料技术”。同时以法规的形式禁止玉米等粮食作物在生物乙醇生产中的应用。在燃料乙醇行业中起作用的主要是纤维素和半纤维素，木质素作为一种副产物，必须采取有效的预处理工艺进行脱除；目前由于五碳糖的发酵相对困难，燃料乙醇行业中利用的主要是纤维素。预处理后通过酸水解或酶水解等方法把木质纤维素生物质中纤维素分解成可用于乙醇发酵的葡萄糖，这个过程称为 “糖化”。经预处理和糖化过程获得的单糖，可直接用于微生物发酵，生产生物乙醇。总的来说，木质纤维素生产燃料乙醇包括预处理、糖化和发酵三个工艺过程。综上所述，纤维素的含量和存在形式直接影响制浆造纸过程中纸浆得率和生物发酵乙醇的产率。因此，通过定向育种手段，提高木材中纤维素的含量在产业上具有重要的经济价值。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本专利技术所提供的培育转基因植物的方法，是降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达，得到与所述目的植物相比，细胞壁中纤维素含量提高的转基因植物。所述4-香豆酸CoA连接酶为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述4-香豆酸CoA连接酶的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)序列表中序列1第180位到1568位所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白的基因；4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白的基因。所述降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达是通过将4-香豆酸 CoA连接酶编码基因的反义基因导入目的植物中实现的。所述4-香豆酸CoA连接酶编码基因的反义基因的核苷酸序列与序列表中序列1 第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补。所述降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达是通过将重组表达载体pAS4CLl导入目的植物中实现的；所述重组表达载体pAS4CLl是通过包括如下步骤的方法制备得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位点和3'端引入^icI和 MlI酶切位点，得到⑶S'基因片段；将所述⑶S'基因片段插入载体PBI121的BamHI和 SacI位点间，替换载体PBI121上的⑶S基因，得到中间重组载体；(2)将与序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从)(bal至MlI的方向插入所述中间重组载体的^CbaI和MlI位点间，得到的重组载体 PAS4CL1。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为毛白杨(Populus tomentosa)0本专利技术的另一个目的是提供一种重组表达载体。本专利技术所提供的重组表达载体，是通过包括如下步骤的方法制备得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位点和3'端引入^icI和 MlI酶切位点，得到⑶S'基因片段；将所述⑶S'基因片段插入载体PBI121的BamHI和 SacI位点间，替换载体PBI121上的⑶S基因，得到中间重组载体；(2)将与序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从)(bal至MlI的方向插入所述中间重组载体的^CbaI和MlI位点间，即得到的所述重组表达载体。所述重组表达载体在提高植物细胞壁中纤维素含量中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为毛白杨(Populus tomentosa)0本专利技术通过转基因技术和反义RNA技术结合，获得4CL基因表达受到抑制的转基因杨树，转基因杨树成熟木材的细胞壁中纤维素含量显著增加，转基因植株较野生型对照4植株细胞壁中纤维素含量增加了 3% -7%。 附图说明图1为毛白杨茎次生木质部的总RNA快速电泳示意图。。图2为4CL特异性RT-PCR扩增产物电泳图。图3为中间载体pBI121-M示意图。图4为植物双元表达载体pAS4CLl示意图。图5为表达反义4CL基因的转基因毛白杨RT-PCR检测结果。图6为表达反义4CL基因的转基因毛白杨Wfestern blot检测结果。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、细胞壁合成相关基因克隆木材即是植物的次生细胞壁，主要由纤维素、木质素和半纤维素三种成分组成，也就是我们通常所说的纤维生物质。利用基因工程方法，改变细胞壁组分，有望提高能源植物生物质在燃料乙醇生产中的利用效率。选择木质素单体合成途径的早期酶促反应的关键酶基因，即4-香豆酸CoA连接酶(4CL，coumarate =CoA ligase)基因，进行表达调控，在改变细胞壁中纤维素、木质素组分的基础上，提高木材原材料的产业应用效率。毛白杨(Populus tomentosa)4CL基因全长cDNA序列是通过反转录PCR(RT-PCR) 方法获得的。首先以毛白杨次生木质部总RNA为模板，通过反转录，合成cDNA第一链；再以 cDNA第一链为模板，通过PCR扩增克隆出全长基因。具体方法如下一、总RNA的分离提取选取田间生长一年以上的毛白杨(Populus tomentosa)(购自宁夏莱州市兴林园艺场)，剥掉树干的树皮后，用手术刀片刮取茎杆外部一层白色组织，作为次生木质部材料用于总RNA的提取。取材过程中所用剪刀、手术刀片均经高温烘烤后使用。刮取的次生木质部材料置于没有RNA酶污染的离心管中，立刻投入本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种培育转基因植物的方法，是降低目的植物中４－香豆酸：ＣｏＡ连接酶编码基因的表达，得到与所述目的植物相比，细胞壁中纤维素含量提高的转基因植物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王宏芝，魏建华，李云伏，李瑞芬，陈亚娟，张中保，张杰伟，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11