一种针对人TNF-α分子的自体疫苗的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种体内诱导出针对人TNF-α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法，采用分步克隆方法构建hTNF-TT830-844，hTNF-HEL46-61，hTNF-PADRE的融合基因，并通过在天然人TNF基因中引入点突变(T439→A、C440→G)优化mRNA二级结构，融合基因克隆入pET22b原核表达载体，在大肠杆菌BL21菌株中获得高效表达。通过计算机辅助分析在hTNF的表位肽结构域之间引入三种T辅助细胞表位肽与hTNF-α融合而克服机体对于自体蛋白的免疫耐受，使得机体发生高水平的体液免疫反应，产生的高水平hTNF-α中和性多克隆抗体在体外可以中和hTNF-α对L929细胞的杀伤活性；其中hTNF-PADRE的免疫原性最强，在不使用免疫佐剂的情况下即可诱发高水平的抗体，该疫苗对于II型胶原诱导的类风湿性关节炎、LPS诱导的恶病质等小鼠模型具有良好的保护和治疗作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物
，具体涉及基因克隆、基因重组、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化等
，进一步涉及一种在体内能够诱导出针对人 TNF-α分子自身抗体的蛋白疫苗的构建方法。
技术介绍
1. TNF- α分子及抗TNF- α治疗的相关研究1.1TNF-α 分子1975年Carswell等发现，卡介苗和细菌内毒素感染的小鼠血清中有一种高活性的肿瘤细胞毒因子，可使肿瘤发生出血性坏死，但对正常组织细胞无杀伤活性，将其命名为肿瘤坏死因子——TNF- α。人TNF- α基因位于6号染色体，基因长41Λ，含4个外显子，与 MHC基因连锁，其前体由232个氨基酸组成，含有76个氨基酸的信号肽。小鼠基因位于17 号染色体，由4个外显子和3个内含子组成，前体由235个氨基酸组成。人和小鼠TNF-α前体有79%同源性，成熟型人TNF-α由157个氨基酸组成，分子量约为17KDa，较小鼠成熟型 TNF在73位多一个组氨酸残基。人和小鼠的成熟型TNF-α均含有两个半胱氨酸(人69、 101位；鼠69、100位)，可以形成分子内二硫键。从细胞株培养上清中分离纯化的TNF-α 在非还原条件下分子量大小不等，在还原条件下分子量为17KDa，与理论分子量一致。这可能是因为TNF-α以不同程度的聚合体形式存在的原因。目前已证实TNF-α活性形式是由 17KDa的亚基组成的同源三聚体。TNF-α是一种多功能的细胞因子。它除了能在体内、外杀伤肿瘤细胞外，还具有诱导炎症反应、抗病毒感染、调节机体免疫、促进细胞增殖和活化等多种功能。TNF-α对肿瘤具有直接抑制和细胞溶解作用，但不同肿瘤株对TNF-α的敏感性不同。TNF-α抗肿瘤机制不完全清楚，目前的研究结果表明TNF-α抗肿瘤的机制主要有(1)通过与肿瘤细胞TNF-α的表面受体结合而发挥细胞毒作用。目前已知的受体有两种，TNFR I和TNFR II，均为跨膜糖蛋白。TNFR I通过其胞浆区的约80个氨基酸残基的死亡区结构域(death domain, DD)介导肿瘤细胞的凋亡。(2)通过对血管内皮细胞的作用，诱导凝血因子的表达，增加纤溶酶原抑制剂的分泌，从而促进血管内凝血及血栓的形成，造成肿瘤组织的局部缺血而坏死。(3)通过介导杀瘤效应细胞的作用和诱导肿瘤局部的炎症反应，促进杀瘤效应细胞的作用。在抗病毒方面，TNF-α可以选择性的杀伤病毒感染的细胞，并对不同的病毒感染具有不同的作用。如对VSV、HSV等病毒具有抑制作用，但是对HIV具有促进作用。另外， TNF-α是重要的炎症因子，一方面它可以刺激内皮细胞表达MHC I类抗原和多种黏附分子的表达，促进IL-1、IL-6的表达，刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎症介质。另一方面 TNF-α可促进中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞黏附在内皮细胞上，从而参与炎症反应。 TNF-α还能够促进T、B细胞增殖，促进抗体产生；活化单核巨噬细胞，提高其杀伤活性；上调巨噬细胞MHC II类分子，提高抗原呈递能力等。1.2 抗 TNF-α 治疗研究发现，TNF-α在体内持续、高水平的表达时在多种疾病中发挥重要的作用， 如恶液质、胰岛素抵抗、感染性休克、炎症反应、自身免疫性疾病等。研制TNF-α拮抗药物为治疗TNF-α水平增高相关疾病提供了一条好的途径。传统的用于治疗体内TNF-α的过量表达相关疾病的药物主要有非甾类抗炎药 (NSAIDS)，缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)，皮质留类、免疫抑制剂和止痛剂。近年来相继问世的新药有氨甲喋呤、来氟米特等。但上述药物均具有较明显的毒副作用。目前研究主要集中于TNF-α拮抗生物制剂，其疗效显著、副作用小。已专利技术的 TNF-α 拮抗药物有 infliximab、etanerc印t、adalimumab、CDP571 和 CDP870。前三种药物已通过FDA批准。Kanerc印t，是基因重组sTNFR75与人IgGFc段的融合蛋白，可同时抑制TNF-α和TNF-β，1998年11月被FDA批准用于治疗青少年RA和腰肌炎。Infliximab，是TNF-α中和性人鼠嵌和抗体，1999年被FDA批准用来治疗RA，后又用来治疗Crohn病。Adalimumab是完全人源化的TNF-α中和性IgGl单克隆抗体，可用于治疗RA和Crohn病。近年来的临床研究表明抗TNF- α在临床治疗RA取得了较好的疗效。2002年美国风湿病学会发布的RA治疗最新指南指出，早期RA患者和使用DMARDS治疗无效的患者对etanerc印t有效。使用足量氨甲喋呤不能控制的进行性活动性的RA患者， etanercept和infliximab联合使用有效，目前推荐单独使用infliximab或与氨甲喋呤联合治疗。TNF- α拮抗药物治疗除了可用于RA外，也可应用于其它TNF- α水平增高相关疾病的治疗，如，恶病质、克隆病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎等。虽然，在临床上TNF- α单克隆抗体和可溶性受体具有较好的疗效，但是，这些药物存在有用药量大、需长期反复使用、易引起超敏反应的缺陷。除此之外，昂贵的药费也是阻碍此类药物广泛应用的原因。据统计，临床上每位接受etanerc印t治疗的病人平均年花费为1. 5万美元，接受Infliximab或Adalimumab治疗的病人平均年花费为9万美元，如此昂贵的药费即使在发达国家也是难以负担的。2.治疗性疫苗2.1研究进展近年来，针对人类自身蛋白的单克隆抗体在治疗急、慢性疾病的过程中显示出了良好的效果。但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了单克隆抗体的广泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对人类自身蛋白的主动免疫疫苗，即用主动免疫的治疗方式替代被动免疫，成为蛋白药物的发展方向。目前，治疗性疫苗的研究已成为一个热点， 涉及很多疾病，如慢性病毒感染、肿瘤、阿尔茨海默病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。治疗性疫苗使人的免疫系统发生有利于患者的反应。大部分的疫苗可以分为两大类一类是诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体；另一类是诱导机体发生细胞免疫反应， 产生细胞毒性T细胞(CTLs)。后一类治疗性疫苗主要用于肿瘤和病毒感染性疾病的治疗。绝大多数的预防性疫苗都是通过诱导抗体的产生来保护机体的，这就证明通过诱导抗体来治疗感染性疾病是一种有效的治疗方法。与预防性疫苗相比，治疗性疫苗的发展相对缓慢，但是近几年单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功预示着治疗性疫苗有着广阔的发展前景。实际上，已经有动物试验表明诱导出一定水平的内源性特异性抗体来治疗疾病是可能的，如针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压；针对IL-9的疫苗可以治疗嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对N-methyl-D-aspartate receptor-1 (NMDARl)的疫苗可以治疗中风。另外，针对一些性激素如人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotro-pin HCG)的免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素(&iRH)的疫苗可以用于治疗晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种体内诱导出针对人ＴＮＦ－α分子的自身抗体的蛋白疫苗的构建方法，其特征在于，将融合基因（ＴＮＦ－α１－１２８－ＰＡＤＲＥ－ＴＮＦ－α１４２－１５７）克隆入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ的Ｎｄｅ　Ｉ和Ｓａｌ　Ｉ多克隆位点之间，将获得的重组表达载体转化大肠杆菌ＢＬ２１，诱导后表达产物为包涵体，经包涵体洗涤，凝胶过滤柱层析，透析复性，即可获得纯化的目的融合蛋白，将该一种体内诱导出针对人ＴＮＦ－α分子的自身抗体的蛋白疫苗，在不使用佐剂的情况下免疫小鼠可产生高滴度抗人ＴＮＦ－α自身抗体，其中所述融合基因序列为：５’－ＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＴＴＧＧＣＴＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣ－３’...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张英起，万一，薛晓畅，王增禄，赵宁，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87