不含选择性标记的转质体植物制造技术

本发明专利技术涉及不含选择性标记的转质体植物，特别是转质体豆科植物，涉及获得这类植物的方法和所用的载体及构建体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及不含选择性标记的转质体(transplstomic)植物、特别是豆科植物， 涉及获得此类植物的方法和所用的载体和构建体。
技术介绍
植物转基因包括向植物中导入来自不同生物体(细菌、病毒、昆虫、植物)的一种或多种基因，目的在于给植物提供新的特性，改善某些农学或食品品质。基因的极度多样性和传统遗传转化技术的发展已导致产生新的植物品种。在某些情况下，由于引入赋予了对除草剂、病原体或不同应激的耐性，有利于作物生产并提高产量。在其它情况下，可改善植物的营养价值和某些基础化合物的含量。大量作物品种属于豆科植物家族，特别是产蛋白植物如豌豆、蚕豆、黄豆、鹰嘴豆、 小扁豆，产油植物如大豆和花生，牧草如苜蓿或三叶草。赋予豆科植物农学价值的的基本性质是其高蛋白含量。这一性质使这些植物成为人们过量表达感兴趣的蛋白质的上选。获得稳定的转基因植物有很多技术，包括将外源基因导入植物的核基因组。另一种获得转基因植物的方式是质体(Plastid)的直接转化。具体而言，质体转化与核转化相比有许多优势，可提及的有-质体转化是通过双重同源重组将基因插入每个细胞内的一个或多个拷贝的环状质体基因组(或质体组plastome)中，优点为精确靶向质体组内需要整合感兴趣的基因的区域，避免核转基因中常见的“位置”效应；-每个细胞可获得极大量拷贝的转基因。具体而言，叶细胞可包含多达10000拷贝的质体组。然后，可操作植物细胞使其含有多达20 000拷贝的感兴趣基因。该特征导致高水平的表达；转基因的产物可能占总可溶蛋白质的40%以上(De Cosa等，2001)。-质体转化的其它优势是极大限制了转基因环境散播的风险。由于质体编码的性状一般不能通过花粉传播，限制了转基因传播到野生物种的潜在风险。最初在单细胞藻类莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中用生物射弹进行质体转化(Boynton等，1988)，该方法现已延伸至烟草(Svab等，1990和1993)。目前，高等植物的质体稳定转化已在烟草植物烟草(N.tabacum)中常规进行 (Svab 和 Maliga，1990 ;Svab 等，199 。近年来对水稻(Khan 和 Maligna，1999)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) (Sikdar 等，1998)、马铃薯(Sidorov 等，1999)、油菜(Chaudhuri 等，1999)和番茄(Ruf等，2001)质体的转化取得了一些进展。多年来未能成功产生可繁殖的转质体大豆植物，直到公开了高频转化大豆质体产生可繁殖植株的新方法和新手段(W0 04/053133)。McBride 等 1994 年的文章、美国专利第 5，451，513 ；5，545，817 ；5，545，818 和 5，576，198号，还有国际专利申请WO 95/16783和WO 97/3四77中更详细描述了质体转化技术。质体转化已用于获得良好水平的除草剂耐性或抗虫性、或者用于大量生产蛋白质。因此，烟草质体组的除草剂如草甘膦(Daniell，1998 ;W099/10513 ;Ye等，2000 ;W0 01/04331，WO 01/04327)或草胺膦(Basta) (Lutz等，2001)的耐受基因过度表达产生了对这些除草剂出色的耐受性。其它应用导致产生对昆虫耐受或过量产生治疗性蛋白的转质体植物(McBride 等，1995 ；美国专利 5，451，513 ；Staub 等(2000) ；WO 99/10513)。然而，如常规进行的高等植物质体的直接转化的一个主要缺点是采用抗生素抗性基因作为选择性标记。通常用于选择转质体品系的选择性标记是细菌基因aadA，它在质体调控元件的控制下表达(Svab等，1993 ；Staub等，1993)。编码氨基糖苷3，-腺苷转移酶的aadA基因的表达产生两种抗生素抗性，即壮观霉素和链霉素抗性。aadA基因产物防止壮观霉素(或链霉素)结合于质体核糖体30S亚基的部件16S RNA (参与识别翻译起始密码子)，从而防止了抑制质体内的翻译。仅有含有表达aadA基因产物的质体的细胞能够继续在体外最优地生长并保持绿色。另一种选择性标记是具有点突变的16S RNA序列，该点突变使其对壮观霉素不敏感。不幸的是，这种抗生素也控制人和动物中的细菌感染。因此，更希望最终产物中不含有该抗生素。因此，人们主要关心可以清除选择性标记基因，特别是抗生素标记基因，同时将感兴趣的基因保持在转基因植物中的方法。在这种情况下，并考虑到质体转化的上述优点，关键是需要开发一种简单可靠的技术以获得没有选择性标记的转质体植物，特别是豆科植物，更具体说是大豆。已经描述了一定数量的用于清除整合入染色体的选择性标记基因的技术，但它们常设计为核转化和/或常常较复杂且可靠性或高或低。这些技术中，采用转座因子(PCT/US91/04679 ；Yoder等199 或位点特异性重组系统如Pl噬菌体的cre/lox系统或酵母FLP/FRT系统(FliI^ase重组酶；Lyzrik等，1997) 除去核转化整合入染色体的标记基因。通过其转运肽将编码靶向叶绿体的CRE蛋白的第二种转基因引入该植物的核基因组中(EP1218488)，位点特异性重组也已应用于清除转质体标记基因。在莱茵衣藻中，基于光合突变体的选择方法使得不用抗生素选择性标记基因如 aadA将感兴趣的外来基因引入质体基因组成为可能。然而，这些方法不能用于高等植物，因为它们以光合突变体的存在为基础。在拟南芥中已采用基于同源重组现象的系统以清除通过核转化所整合的标记基因(W0 01/96583)。此法中，采用包含环绕有阳性选择性标记基因和阴性选择性标记基因的两拷贝相同取向的感兴趣基因的载体转化植物。所述阳性选择性标记基因使该方法能选出基因组中整合了转基因的植株。两拷贝感兴趣基因使该法能通过同源重组而去除两种(阳性和阴性)选择性标记基因与感兴趣基因两拷贝中的一个拷贝。经历此同源重组后缺乏阴性选择性标记基因的植物时能被选出。这种阴性选择性标记基因的一个例子是CodA基因 (大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶)，该酶可使5-氟胞嘧啶(无毒性)脱氨成为毒性的5-氟尿嘧啶。WO 06/07260中，作者开发了一种新的可靠方法以产生无标记的除草剂耐受植物。 将包含插入在HPPD编码区分别对应于该蛋白质NH2-末端与COOH-末端的两片段(这两个序列有403个核苷酸的Pl片段重叠)之间的aadA选择盒的遗传构建体引入烟草植株的质体组中。利用质体基因组内的同源重组，将两拷贝的Pl (片段)重组在质体基因组中。这导致去除该aadA盒而恢复功能性全长HPPD编码区，从而赋予重组质体转基因植物DKN耐受性。由于能够对DKN进行选择，从而加速和促进了含HPPD基因但缺乏aadA基因的同质植物的产生。本申请公开了去除这种选择性标记的新方法和手段，使其对于任何感兴趣基因更容易甚至更可靠，即使是恢复时不会赋予所述植物新的选择性特性的基因。附图说明图1 含串联双顺反子的构建体，包含在玉米(Zea mays)Prrn启动子控制下的 aadA基因和gfp基因，此二基因分别插入在烟草ftrri启动子控制下bar基因的5’ -末端序列(本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种构建体，其在转录方向上含有至少（ｉ）编码能赋予对选择试剂抗性的选择性标记嵌合基因，和（ｉｉ）嵌合色素基因、或编码发光蛋白的嵌合基因、或编码阴性标记的嵌合基因；二者分别插入在感兴趣嵌合基因的５’－末端序列与３’－末端序列之间，这二个序列含有长度适合它们重组的重叠片段，其中当嵌合基因（ｉｉ）编码阴性标记时所述感兴趣基因不作为全长基因存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·杜巴尔德，
申请(专利权)人：拜尔农科股份公司，
类型：发明
国别省市：DE