用于生产核黄素的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术发酵生产核黄素（在下文中也称作维生素Ｂ２）的方法和手段，和实施所述方法的手段，特别是具有提高的核黄素产率的经修饰的微生物宿主细胞。本发明专利技术因此公开了调节参与宿主细胞核黄素生产的酶活性的表达的新颖方法和手段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及生物技术发酵生产核黄素(下文中也称作维生素B2)的方法和手段， 和实施所述方法的手段，特别是具有提高的核黄素产率的经修饰的微生物宿主细胞。本专利技术因此提供了调节参与宿主细胞核黄素生产的酶活性的表达的新颖方法和手段。核黄素是黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体分子。它们是生物细胞和生物体中大量酶促氧化还原反应的必需辅助因子。因此，核黄素是食物和动物饲料工业中重要的添加剂。在微生物和植物中，核黄素通常从三磷酸鸟苷(GTP)(来自嘌呤代谢)和5-磷酸核酮糖(来自磷酸戊糖途径)通过七个酶促反应合成。每年约有4000吨核黄素在多种微生物中被以生物技术方式生产。最重要的宿主生物是杆菌(bacilli)，特别是Bacillus subtilis。除此之外也使用其他微生物细胞，包括 {1 , ^° 歹lliiL Eremothecium ashbyii>Ashbya gossypii 禾口 Candida f已mata。用于核黄素合成的已知生物技术方法需要改进，最重要的是改进核黄素的产率和生产。因此需要提供经改进的生产方法和经改进的宿主细胞，特别是以微生物Bacillus subtilis为基础来改进。这特别涉及下述手段的提供，所述手段使得能够特别简单和有效地控制宿主细胞中的代谢活性，特别是与核黄素合成相关的酶活性。另外，这涉及提供经修饰的宿主细胞，所述经修饰的宿主细胞特别是与野生型相比具有提高的核黄素合成。本专利技术人惊讶地发现，转录因子CcpC对核黄素生产率(production rate)具有积极影响。CcpC属于LysR转录因子家族，已知其能调节编码三羧酸循环(TCA)酶活性的基因，最重要的是citB和citZ。惊讶地发现核黄素产率直接依赖于转录因子CcpC的活性和 /或细胞内浓度。降低的CcpC活性导致产率的提高。该效应是令人惊讶的，并且从现有技术不可预测，因为已知受CcpC调节的TCA中的酶活性与核黄素合成的代谢途径并无直接关联。还令人惊讶的是生物量生产，特别是根据本专利技术被修饰的细胞(特别是CcpC-缺失的细胞，例如的ccpC敲除转化体)的生长率保持基本不变。本专利技术因此涉及经修饰的生产核黄素的细胞或细胞系，原核细胞或真核细胞，特别是微生物细胞，其特征在于CcpC型转录因子和/或在细胞中存在和/或表达的其同系物或直系同源物的活性或浓度被修饰，特别是被降低。通过所述修饰，细胞或细胞壁能够进行提高的核黄素生产。特别地，要求保护下述经修饰的生产核黄素的微生物，其中与未经修饰的微生物或野生型微生物相比，CcpC型转录因子的表达和/或活性被降低，优选地降低至少25%。优选地，上述细胞或细胞系被修饰，使得编码CcpC的基因完全不表达(表达的阻抑)或至少显示降低的表达(低表达(underexpression))，这导致所述细胞/细胞系中缺失或减少/降低的CcpC蛋白质活性。细胞/细胞系优选地是CcpC缺失的(CcpC-cbpleted) 突变体或转化体，特别是编码CcpC的至少一个基因和/或其同系物和/或直系同源物的敲除突变体。在该关联中，“降低的”被理解为表示在作为转录因子的功能方面，CcpC蛋白质或其同系物或直系同源物的减少的、特别是缺失的活性，以及ccpC基因或其同系物或直系同源物的减少的、特别是缺失的表达，结果，这使得细胞(特别是CcpC缺失的细胞)中基因产物CcpC拷贝数低或浓度低。降低的表达被理解为表示以未经修饰的(CcpC野生型)细胞 /细胞系中ccpC基因的表达为基础至少25 %的减少，优选地至少50 %、75 %、80 %、90 %、 95%、98%或100%的减少。所述降低既涉及基因活性又涉及相应的基因产物。因此，在根据本专利技术的细胞或根据本专利技术被修饰的细胞中，最重要地，当所述基因例如在杆菌中、优选地在生物Bacillus subtilis中表达时，ccpC基因和/或其基因产物被阻抑、“敲除”或其功能(活性)受损，特别是与CcpC野生型相比。用于测量基因或蛋白质活性的多种方法是本领域技术人员已知的。合适的方法例如是Northern印迹，或用于测量ccpC基因活性的用途的“基因芯片，，方法，和借助于针对 CcpC的特异性抗体的Western印迹，或用于测定细胞中蛋白质浓度的定量“2_D SDS-PAGE 凝胶”。转录因子(特别是CcpC)的活性也可以通过“凝胶迁移(gel shift)”实验来间接测定，其中测量在要被调节的基因(例如CitB或citZ)的相应结合位点处结合的CcpC的量。通过减少ccpC的基因表达，结合的CcpC量也会降低，这可通过聚丙烯酰胺凝胶上信号的定量测量来分析。这些测量方法和其他测量方法是本领域技术人员已知的，并且可用于测定本专利技术意义上的CcpC活性。用于实施本专利技术的合适细胞或细胞系(概括为宿主细胞)是所有已知的下述生产核黄素的细胞，其中ccpC基因或其同系物或直系同源物的表达可以被降低。例子是原核细胞或真核细胞，优选地是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，特别是微生物细胞例如 Bacillus、Corynebacterium 或 Pseudomonas0 优选的是 BaciIlus 属的细胞，例如 Bacillus anthracis> Bacillus cereus、Bacillus stearothermophilus> Bacillus halodurans> Bacillus amyloliquifaciens 或 Bacillus subtilis,Bacillus subtilis 是特别优选的， 例如 B. subtilis 168。适用于本专利技术的一种特别优选的宿主细胞是B. subtilis RB50::n，其包含多个拷贝(例如约5到约20个拷贝)的质粒pRF69，所述质粒pRF69编码经修饰的核黄素(rib)操纵子，其中修饰在于强启动子Psp。15的插入，这导致核黄素基因转录的强化(菌株的构建和用于提高核黄素合成的培养条件见例如EP 405370和Perkins et al.，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，22 :8-18,1999)。B. subtilis RB50 和质粒 pRF69 根据布达佩斯条约的规定，分别以编号(“保藏号”)B 18502保藏在“Agricultural Research Culture Collection”(NRRL)，Peoria, IL, USA, Culture Collection Division 和以编号(“保藏号，，)ATCC 68338 保藏于“American Type Culture Collection”(ATCC)，P. 0. Box 1549， Manassas, VA 20108 USA。在本专利技术的一个优选的方面，在Bacillus属的菌株(特别是Bacillus subtilis) 中实现ccpC基因中的修饰。本文特别优选的是核黄素操纵子中脱调节的作为宿主细胞的 Bacillus菌株，特别是subtilis菌株。脱调节的核黄素操纵子的例子是已知的，并且包括所谓的“ribO”和“ribC”突变。脱调节引起rib本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．经修饰的生产核黄素的微生物，其特征在于，与未经修饰的野生型微生物相比，ＣｃｐＣ型转录因子的表达和／或活性被降低，优选地被降低至少２５％。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗洛瑞娜·柯克纳，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL