本文描述了含有编码免疫避孕蛋白，例如促性腺激素释放激素（ＧｎＲＨ）或透明带３（ＺＰ３）的异源核酸序列的重组狂犬病毒。本文公开的重组狂犬病毒通过反向遗传学回收，复制高效，在接种的动物中引发狂犬病毒中和抗体和免疫避孕肽特异性抗体，并保护接种的动物抵抗野生型狂犬病毒的激惹。此外，还提供了免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并在同时抑制动物生育力的方法，所述方法包括给药包含上述一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及作为免疫避孕组合物用于控制野生和驯养动物的种群增长并保护动物抵抗狂犬病毒感染的重组狂犬病毒。
技术介绍
狂犬病是对公共卫生的重要威胁，每年引起50，000至60，000人死亡(世界卫生组织(World Health Organization)，2003年4月)。人类被狂犬病毒感染主要是通过患狂犬病的驯养和野生动物的叮咬。在发展中国家，约94%的人类狂犬病死亡是由狗造成的。 狗狂犬病仍然在非洲、亚洲和南美洲的大多数国家的动物中流行，并且在这些国家中，大多数人类的患病死亡由狗造成。因此，在驯养和野生动物中控制狂犬病毒感染，不仅将在这些动物中降低死亡率，而且将降低人类暴露的风险。狂犬病毒由被感染动物的叮咬或抓伤引起的破裂皮肤传播。暴露于狂犬病毒导致其侵入外周无髓鞘的神经末梢，然后通过逆向轴突运输传播，专门在神经元中进行复制， 并最终达到中枢神经系统(CNQ。CNS的感染引起细胞机能障碍和死亡(Rupprecht和 Dietzschold, Lab Invest. 57 603,1987) 因为狂犬病毒直接在细胞间传播，因此它大多避开免疫识别(Clark和I^rabhakar，“狂犬病”(Rabies)，在Olson等主编的《病毒性疾病的比较病理学》中(Comparative Pathology of Viral Disease) 2 :165，Boca Raton, FL, CRC Press,1985)。使用旧式的捕捉、监禁和安乐死方法控制狗的种群是不人道的，并且不被公众接受。犬类狂犬病防控和自由放养狗的适合的种群管理，对于最终消灭疾病来说是至关重要的。已经提出了各种手段来打断犬类的繁殖周期，包括动物的手术切除卵巢/阉割、化学绝育和免疫避孕。例如，作为用于狗的免疫避孕肽，促性腺激素释放激素(&iRH)已被当作一种手段。但是，到目前为止的研究显示，&iRH需要被合成并与载体蛋白(或佐剂)结合才具有免疫原性。必需的生产放大在满足现代疫苗供应的法规和经济要求方面，可能有问题。 因此，构建一种在动物中单次给药后能够诱导适合的针对狂犬病毒和免疫避孕靶两者的双重免疫应答的疫苗，将是理想的。此外，在过去30年间，免疫避孕研究还未能产生一种商业化产品。技术限制是主要因素之一。因此，对于工程化改造的、具有表达适合的免疫避孕基因的能力的新的狂犬病毒疫苗，存在长期以来没有被感觉到的需要。这种类型的疫苗将是用于野生和驯养动物包括狗的狂犬病预防和种群控制两者的理想候选物。专利技术概述本文公开了包含编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列的重组狂犬病毒。重组狂犬病毒使用反向遗传学回收，在培养物中高效复制，并引发高滴度的狂犬病毒中和抗体，引发免疫避孕蛋白特异性抗体，并在接种的动物中提供针对狂犬病毒激惹的保护作用。本文提供了重组狂犬病毒，其中重组狂犬病毒的基因组包含编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列。在某些实施方案中，免疫避孕蛋白是促性腺激素释放激素(&1RH)或透明带 3(ZP;3)，例如狗ZP3。在某些实施方案中，重组狂犬病毒的基因组包含编码ZP3的核酸序列和编码&iRH的核酸序列。还提供了包含本文描述的一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物。还提供了包含第一种重组狂犬病毒和第二种重组狂犬病毒的免疫原性组合物，其中第一种重组狂犬病毒的基因组包含&1RH核酸序列，并且第二种重组狂犬病毒的基因组包含ZP3核酸序列。还提供了通过向动物给药治疗有效量的包含本文公开的一种或多种重组狂犬病毒的免疫原性组合物，来免疫非人类动物以抵抗狂犬病毒感染并抑制动物生育力的方法。从下面几个实施方案的详细描述并同时参考附图，上述以及其他的特点和优点将变得更加明显。附图简述附图说明图1是四种重组ERAZP3病毒的示意图。G*表示在糖蛋白(G)的333位氨基酸处的突变。ZP-表示狗的透明带基因。图2A是狂犬病毒糖蛋白的示意图。箭头指示了一个或两个&1RH拷贝插入的位置。 通过反向遗传学成功地回收到在每个这些位置带有插入的&iRH的重组病毒(Ecto =胞外结构域；SP =信号肽；TM =跨膜；nb、II、IIa、WB+和III是指抗原性位点)。图2B是重组狂犬病毒ERA-3-GnRH的示意图。图3A是列出了包含狗ZP3 (DZP3) ,GnRH或两者的示例性重组狂犬病毒的表。病毒描述指示了 ZP3和/或&iRH在病毒基因组中插入的位置(G3 =具有G333突变的糖蛋白)。 图:3B是显示了未接种的小鼠(对照)或用ERA-N-GnRH (5号病毒)、ERA-3-GnRH(7号病毒) 或ERA-G3-2&iRH(8号病毒)接种的小鼠的存活率的图。每组小鼠随后用致死剂量的狂犬病毒激惹。图4是蛋白凝胶的照片，显示了与匙孔血蓝蛋白(KLH)结合的&iRH或2&1RH肽。 蛋白在4-12% SDS-PAGE凝胶上分离。GnRH-KLH和2GnRH_KLH分别显示在第2和4道中。 第1和6道含有分子量标志物。第3和5道显示了 KLH标准品。图5A是亲代ERA和重排的ERAg3p基因组的示意图。为了产生ERAg3p，将ERA基因组中的G基因重新定位在P基因前面，并在333位氨基酸残基处从AGA(命名为G)突变成GAG(命名为(T)。图5B是一步生长曲线，显示了重排的ERAg3p病毒的生长特性。回收的ERAg3p病毒以及亲代ERA病毒进行了生长。图5C是比较ERA与ERAg3p的毒力的线图。 在脑内注射后，ERAg3p不引起任何3周龄小鼠的死亡。图6是显示了 ERAg3p狂犬病毒G基因中GnRH或2GnRH编码序列的插入位点的示意图。SP =信号肽；TM =跨膜；CT =胞质尾巴；N =糖蛋白的氨基末端，以及C =糖蛋白的羧基末端。图 7A 是显示为了产生 ERA-N-GnRH、ERA-N_2GnRH、ERA-IIa-GnRH 和 ERA-C-GnRH， GnRH在ERAg3p基因组中的插入位点的示意图。图7B是线图，显示了带有GnRH的ERAg3p 病毒的回收和生长特性。从12个构建物中的4个中成功回收了重组病毒。回收到的病毒含有插入到紧靠糖蛋白的信号序列、IIa抗原性位点或胞外结构域与跨膜结构域之间的连接处后的氨基末端处的&1RH。图8A是电泳凝胶的照片，显示了纯化的ERA-N-2GnRH (第1道)、ERA-N-GnRH (第 2道)和ERA-IIa-GnRH(第3道)。纯化的病毒在4-12% SDS-PAGE凝胶上分离。第4和 5道含有来自狂犬病毒ERA的纯化的糖蛋白和纯化的核蛋白作为对照。图8B是纯化的 ERA-N-2GnRH(第2道)和ERA-N-GnRH (第3道)的Northern印迹照片。第1和4道含有 RNA分子量标志物。图9是线图，显示了带有&iRH的ERAg3p病毒在小鼠模型中的安全性和效力。肌肉内注射ERA-N-2GnRH、ERA-N-GnRH或ERA-IIa-GnRH后，在小鼠中没有观察到明显的副作用。在接种后三周，用约2. 5-10. OMICLD50狗/丛林狼(coyote)街狂犬病毒的致死剂量激惹的所有小鼠都存活。对照小鼠(注射空白本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组狂犬病毒，其中重组狂犬病毒的基因组包含狂犬病毒核蛋白（Ｎ）、磷蛋白（Ｐ）、基质蛋白（Ｍ）、糖蛋白（Ｇ）和ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶（Ｌ）基因以及编码免疫避孕蛋白的异源核酸序列，其中免疫避孕蛋白选自促性腺激素释放激素（ＧｎＲＨ）和透明带３（ＺＰ３）。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：查尔斯·拉普里奇特，
申请(专利权)人：美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心，
类型：发明
国别省市：US
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